超顺磁性Fe3O4磁共振对比剂的合成及其T2-加权成像性能研究*

杜庆波 方迎春 谢小雪 刘龙刚 尹辉

(皖北卫生职业学院 宿州安徽 234000)

超顺磁性氧化铁(Fe3O4)纳米粒子(SPIONs)由于具有强磁性和高磁化率，已在磁共振成像，磁性引导的药物输送，热疗和细胞分离中显示出巨大的应用前景[1-4]。由此备受研究人员的关注[5-8]。多种方法被用于合成磁性Fe3O4纳米颗粒，如化学共沉淀法、溶剂热法和超声化学法等[9-13]。Zhang等[14]以乙醇为溶剂，采用一种简单方便、经济环保的溶剂热法制备了不同形貌的磁铁矿(Fe3O4)纳米结构，包括由磁铁矿纳米粒子组成的规则磁铁矿亚微米球，空心的磁铁矿团聚体和单分散磁铁矿纳米粒子。制备的磁铁矿纳米粒子具有明显的超顺磁性行为，在生物技术应用中显示出巨大的潜力。研究了制备的磁铁矿纳米粒子的体外和体内磁共振成像能力。Dutta等[15]开发了表面功能化的Fe3O4磁性纳米粒子(MNPs)系统，可用于肿瘤靶向多模式治疗和MR成像。该方法将生物相容性的非必需氨基酸(谷氨酸)引入Fe3O4mnps表面，为化疗药物的结合提供功能位点。这些谷氨酸包覆的Fe3O4mnps(GAMNPs)具有良好的水分散性、磁响应性和pH依赖性电荷反转特性。采用XRD、TEM、DLS、FTIR、PPMS、紫外可见光谱、zeta电位分析仪等对GAMNPs的磁芯和有机壳层进行了表征。将广谱抗癌药物盐酸阿霉素(DOX)和甲氨蝶呤(MTX)分别与GAMNPs表面静电偶联和共价偶联，用于联合化疗。这些双载药系统(DOX-MTX-GAMNPs)显示了两种药物的pH依赖性释放行为，并且与单独治疗相比，对乳腺癌细胞系MCF-7的毒性增强。流式细胞术分析证实MCF-7株细胞摄取成功。另外，MTX是叶酸的类似物，它与DOX的共传递将有助于这两种药物内化到MCF-7细胞中。这些GAMNPs在交流磁场下也显示出良好的加热效率(在Fe浓度分别为0.5、1和2mg/ml时，ILP分别为0.95、0.73和0.48nHm2/Kg)和横向弛豫性(r2=152mM-1s-1)，表明它们具有热疗和磁共振跟踪的潜在能力。此外，还观察到化疗药物和热疗联合使用可增强MCF-7细胞的细胞毒性。

虽然报道的方法在制备具有可调尺寸和表面性质的Fe3O4纳米粒子方面取得了巨大成就，但合成工艺一般不环保、经济。例如，在热分解过程中通常采用的Fe(CO)5是高度毒性的，并且在热分解过程中必须使用一些昂贵的试剂，如油胺和1-十八碳烯[16]。因此，开发一种简便、经济的合成策略，制备Fe3O4纳米颗粒，不需要昂贵和有毒的试剂来满足不同的大规模应用要求已成为当务之急。在此，笔者报道了一种简单方便，低成本和环境友好的合成方法，通过简单的溶剂热过程以乙二醇为溶剂，制备超顺磁性、单分散的Fe3O4纳米颗粒。采用多种现代技术手段对制备的Fe3O4纳米颗粒进行表征，综合样品的结晶性、形貌和磁性能，选取在180oC加热8h制备的Fe3O4(F3)纳米颗粒为研究对象，采用MesoMR23-060H-I低场核磁共振成像与分析系统对制备的Fe3O4(F3)纳米颗粒的体外成像性能进行研究。实验结果表明：所获得的Fe3O4(F3)纳米颗粒具有超顺磁性和优异的体外磁共振成像(MRI)性能。

1试验部分

1.1试验仪器

实验用仪器详见表1。

表1 试验仪器

1.2试验试剂

实验试剂主要有分析纯硝酸铁(≥99.0%)、水合肼(≥85.0%)、乙二醇(≥99.0%)、聚乙二醇(≥99.0%)来自国药集团化学试剂，分析纯无水乙醇(≥99.0%)来自安徽安特食品股份有限公司。

1.3 Fe3O4磁共振对比剂的制备

取聚乙二醇4000(PEG)0.6g，硝酸铁(Fe(NO3)3·9H2O)1mmol，放入50mL洁净干燥的烧杯中，加25mL乙二醇，磁力搅拌使溶解，然后用移液管逐滴加入2mL水合肼，磁力搅拌10min，将所得褐色浆液转移至50mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中，旋紧，将反应釜放入烘箱中180oC反应8h，取出反应釜，自然冷却至室温。收集所得样品，用无水乙醇洗涤5次，60oC真空干燥12h，备用。合成路线如图1所示，不同实验条件下所制备的样品(F1-F5)列于表2。

图1 溶剂热法合成超顺磁性Fe3O4 纳米颗粒的示意图

表2 不同Fe3O4 样品的实验条件

1.4超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的体外成像实验

采用MesoMR23-060H-I低场核磁共振成像与分析系统(磁体强度0.5T，线圈直径为60mm，磁体温度为32℃)，对超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的体外成像效果进行研究。配制6个浓度梯度溶液。将配置好的造影剂溶液超声3min后立即放入样品槽中测试。

实验参数：

(1)T1弛豫时间测试(IR)：SFO1=21.768MHz，P1=11us，P2=22us，SW=100KHz，TW=28000ms，RFD=0.08ms，RG1=20db，DRG1=3，NS=2，NTI=25.

(2)T2弛豫时间测试(CPMG)：SFO1=21.768MHz，P1=11us，P2=22us，SW=100KHz，TW=8000ms，RFD=0.08ms，RG1=20db，DRG1=3，NS=2，TE=0.8，NECH=10000.

(3)T2加权像测试参数：FOVRead=80mm，FOVPhase=80mm，Slice=1，SliceWidth=5mm，K空间大小256×192，TR(ms)=1400ms，TE(ms)=100ms，Average=6.

而入门的小学生和初中低年级学生，处境就比较尴尬。从国外引进的童书绘本中，以外研出版社引进的偏文字英语故事书为主，对英语入门级学生而言难度偏高；其他出版社，更多为直接出中文译作。而承载着认知启蒙、培养语言兴趣使命的入门级英语原版绘本，市面上实在是少之又少（漆秋香，2015），视听资源更是缺乏。偶尔出现，价格还偏高。正版资源少，盗版也是无源之水。

2结果与讨论

2.1 Fe3O4的物相与形貌分析

采用X射线粉末衍射仪对制备的Fe3O4样品的晶体结构，结晶性能和相纯度进行表征，结果如图2(a)所示。

图2 样品F3的XRD图(a)和EDS图(b)

图2(a)中，衍射峰出现在2θ值为30.1，35.4，43.1，53.2，57.0，62.7和74.0处有7个衍射峰，分别对应于尖晶石结构Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)，(440)和(533)晶面。衍射峰位置和相对强度与Fe3O4标准峰值一致 JCPDS：19-0629)[7、17-18]。没有观察到其他杂质峰，表明制备的Fe3O4纳米颗粒具有立方结构。图2(b)为制备的Fe3O4纳米颗粒的EDS图谱，图中显示样品仅由铁和氧两种元素组成，且铁和氧两种元素之比(Fe/O=1：1.15)接近Fe3O4的化学计量比，说明样品为Fe3O4。

图3(a)证实成功合成了大量球形Fe3O4NP，从图中可以看出样品为大量纳米粒子的聚集体。由于样品的磁性能和表面能较高，颗粒之间团聚较严重。图3(b)表示样品的TEM图像，从中可以看出，样品显示出具有均匀形状和窄尺寸分布，纳米颗粒的直径约为20nm。图3(c)HRTEM图像表明，所获得的Fe3O4本质上是高度结晶的，晶面间距为0.296nm，与Fe3O4220)晶面匹配[7]。图3(d)显示了合成的Fe3O4纳米粒子的SAED图像，图中显示样品是令人满意的立方尖晶石晶体结构的多晶体。

图3 样品F3的扫描电镜图像(a)；透射电镜图(b) 像；高分辨透射电镜图像(c)；选区电子衍射 图像(d)

采用XPS在0-1200eV的范围内分析Fe3O4样品的表面元素组成和氧化态，结果如图4所示。

图4 样品F3的XPS全谱(a)；高分辨Fe2p(b)； 高分辨O1sF3(c)

图4(a)为Fe3O4样品的XPS全谱，它表明样品含有Fe、O和C三种元素，其中C元素来源于样品表面残留的高分子有机物；图4(b)显示了Fe2p区域的高分辨率XPS光谱，对于Fe2p，典型的Fe2p为710.9和724.3 eV的宽峰，分别对应于Fe3O4的Fe2p3/2和Fe2p1/2自旋轨道峰，这意味着形成 Fe (II)和Fe(III)的混合氧化物，结果与文献报道的Fe3O4值一致[19-21]；图4(c)为O1s区域的高分辨率XPS光谱，530.2eV处的峰值是与Fe3O4相对应的Fe-O物种的典型状态[22]。

2.2 Fe3O4的磁性和表面成分分析

使用SQUID磁力计在室温下对合成的Fe3O4纳米颗粒的磁性能进行研究，如图5(a)所示。图5(a)显示合成 的Fe3O4纳米颗粒磁化曲线呈典型的“S”型，表现出超顺磁性，而几乎没有磁滞，其饱和磁化值和矫顽力分别为66.9和27.9emu/g。图5(a)右下角的插图为样品在磁场范围-1000～1000 Oe的磁滞回线，从图上可以清楚的观察到样品很小的剩余磁化强度和矫顽力。这种低的剩磁可能归因于Fe3O4纳米颗粒的小的磁各向异性[23-24]。

图5(b)显示纯PEG和PEG/Fe3O4纳米复合材料的FTIR光谱。分别在2860cm-1和1420～1450cm-1处观察到的宽带归因于吸附水，这归因于O-H和H-O-H组的振动[23]，在PEG/Fe3O4和空白PEG中均观察到了这些谱带，但是获得了不同的强度。560cm-1附近的谱带对应于拉伸振动，这是由于氧与占据PEG/Fe3O4纳米复合材料四面体位点的阳离子之间的相互作用而产生的[25]。纯PEG样品在3400～3450cm-1和1000～1030cm-1处给出清晰的谱带，表明存在-OH和C-O组振动模式。1200～600cm-1和2880～1600cm-1之间的频带分别对应于C-H组弯曲和拉伸振动的平面变形。1470cm-1处的谱带是由于PEG的C-C拉伸振动[26]。

图5 样品F3的室温磁滞回线(a)和FTIR光谱(b) (右下角插图是局部放大图)

2.3试验条件对Fe3O4物相，形貌及磁性能的影响分析

图6为不同反应时间和温度条件下所得Fe3O4样品的XRD图谱。图中显示在不同的实验条件下所得样品均为Fe3O4。图中2θ=30.41，35.71，43.41，57.21和62.91处的衍射峰分别归属于立方相Fe3O4(JCPDS：19-0629)的(220)、(311)、(400)、(511)和(440)晶面。从图6可以发现，随着反应温度的升高和反应时间的延长，样品的XRD衍射峰增强，说明样品的结晶性增加。

图6 不同样品的XRD图谱(F1，F2，F3，F4和F5)

为了研究反应时间和反应温度与样品的形貌、尺寸之间的关系，采用SEM对不同实验条件下所得的样品进行表征，结果如图7所示。

图7 不同样品的扫描电镜图像 (a)F1；(b)F2；(c)F3；(d)F4；(e)F5

图7证实合成的Fe3O4纳米材料均为球形颗粒，且平均直径为10～20nm。由于磁性纳米颗粒之间偶极-偶极相互作用和大的表面能，纳米颗粒之间存在不同程度的团聚。

使用磁学测量系统(SQUID)在室温下对各种实验条件下合成的Fe3O4纳米颗粒的磁性能进行研究，结果如图8所示。

图8 不同样品的室温磁滞回线(F1，F2，F3，F4，F5)

磁化曲线几乎没有矫顽力和剩余磁化强度，在外磁场下磁化强度基本达到饱和，表明合成的Fe3O4纳米颗粒在室温下具有典型的超顺磁性[27]。磁性纳米颗粒在室温下的这种超顺磁性使得Fe3O4纳米颗粒具有广泛的应用的潜力，例如药物递送、生物分离和磁共振成像[28-32]。这一结果与Fe3O4纳米粒子的临界尺寸有关，粒径小于25nm时可以观察到超顺磁性[33]。

在各种实验条件下制备的Fe3O4纳米颗粒的饱和磁化强度、剩余磁化强度和矫顽力列于表3中。

表3 不同Fe3O4纳米颗粒的磁性能

从表3可以看出，饱和磁化强度值随着反应时间的延长和反应温度的升高而增加；剩余磁化强度和矫顽力随着反应时间的延长和反应温度的升高而减小。实验数据说明反应时间和反应温度对样品的磁性能有重要影响。

2.4 Fe3O4的磁共振成像性能

近年来，MRI已成为诊断癌症最有效的工具之一。在这项技术中，注射铁磁流体的活体内的不同软组织，将通过这些组织内磁矩的不同弛豫时间T2来区分。如果使用的铁磁流体可以在T2值之间提供明显的组织间差异，则将以高对比度获得高分辨率的MR图像。在这里，将对180oC反应8h条件下制备的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒(F3)的体外成像效果进行研究。图9(a)和(b)为1/T1和1/T2弛豫时间随Fe3O4的浓度变化关系，纵向弛豫率(r1)和横向弛豫率(r2)分别为0.111 ug·mL-1s-1和2.186 ug·mL-1s-1，r2/r1=19.7，具有更强的横向对比度增强，说明制备的超顺磁性氧化铁纳米颗粒更适合作为T2磁共振对比剂[32， 34]。从图9 (c)中可以清楚地看出，在灰度图中随着样品浓度的增大，MR图像的信号强度呈现负增强；在彩色图中，很明显随着Fe3O4纳米颗粒的浓度增加，图像颜色红色变为蓝色，表明MRI信号强度逐渐增加，这种现象与基于灰度图强度的观察结果一致。表明制备的Fe3O4纳米颗粒(F3)是潜在的T2造影剂。

图9 样品F3的T1(a)；T2弛豫效率(b)； T2加权成像(c)

3结论

文章采用溶剂热法成功合成了Fe3O4@PEG纳米颗粒，使用多种方法表征了样品的结构、形态、磁化性质和MRI成像性能。合成的Fe3O4纳米颗粒表现出超顺磁行为和高饱和磁化强度。研究了反应时间和温度对样品形貌、尺寸、结晶性和磁学性能的影响。综合考虑实验数据，选取在180oC反应8h条件下制备的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒(F3)为研究对象，采用MesoMR23-060H-I低场核磁共振成像与分析系统对其体外成像效果进行成像分析研究。研究结果表明，合成的超顺磁性Fe3O4@PEG纳米粒子(F3)可能是一种很有应用前景的T2造影剂。