胰岛素样生长因子1受体抑制剂对甲磺酸伊马替尼继发耐药性胃肠道间质瘤细胞增殖及蛋白激酶B蛋白磷酸化的影响▲

秦 龙 罗彬予 李 婷 吕真冰

(川北医学院第二临床学院/南充市中心医院胃肠疝外科，四川省南充市 637000，电子邮箱：long821127@126.com)

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，主要与原癌基因c-kit或血小板源性生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRA)基因突变有关[1]。选择性c-kit/PDGFRA受体酪氨酸激酶抑制剂—甲磺酸伊马替尼的问世，破解了GIST的治疗难题[2]。但随着治疗的深入，甲磺酸伊马替尼继发性耐药已成为GIST临床治疗的主要问题。目前，有关甲磺酸伊马替尼继发性耐药发生机制的研究主要集中于c-kit/PDGFRA基因二次突变诱导的受体再激活，但这尚不能充分阐明其耐药机制。Tarn等[3]的研究表明，发生甲磺酸伊马替尼继发耐药的GIST患者存在胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)基因扩增的现象。而IGF-1R同属于酪氨酸激酶受体，与配体结合后可引发下游信号通路的级联反应，从而促进细胞增殖[4]。本研究采用IGF-1R抑制剂AG-1024干预甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST细胞，了解细胞凋亡相关生物学特性及其可能分子机制，为甲磺酸伊马替尼继发耐药的GIST患者的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 甲磺酸伊马替尼购自爱必信(上海)生物科技有限公司(批号：abs817884)，GIST-T1细胞购自上海钦诚生物科技有限公司；胰酶(批号：Z9503)和胎牛血清(批号：10099141C)购自北京智杰方远科技有限公司；IGF-1R抑制剂AG-1024购自美国Selleck Chemicals公司(批号：S1234)；蛋白激酶B(protein kinase B,Akt；批号：# 9272)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt；批号：# 9271)及β-肌动蛋白(β-actin；批号：# 5816)抗体购自Cell Signaling公司；聚偏二氟乙烯膜(批号：03010040001)购自Sigma-Aldrich公司；预染蛋白Marker购自上海钰博生物科技有限公司(批号：YBD1084)；增强发光试剂盒购自上海锐赛生物技术有限公司(批号：D003-1)。杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)购自Sigma-Aldrich公司公司(批号：56436C)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞的诱导和鉴定：将GIST-T1细胞系置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待GIST-T1细胞进入对数生长期后，以终浓度为25 μmol/L的甲磺酸伊马替尼作为起始浓度处理细胞，48 h后更换不含甲磺酸伊马替尼的培养液继续培养至细胞融合度达80%，传代；待细胞进入对数生长期后，更换含有终浓度为25 μmol/L的甲磺酸伊马替尼的培养液处理48 h，如此反复直至GIST-T1细胞在含有终浓度为25 μmol/L的甲磺酸伊马替尼的培养液中正常生长，再增加甲磺酸伊马替尼浓度至终浓度为37.5 μmol/L，继续诱导细胞耐药性，细胞稳定生长后再逐渐增加甲磺酸伊马替尼浓度至50 μmol/L直至细胞稳定生长。检测耐药GIST-T1细胞的甲磺酸伊马替尼半数抑制浓度，实验重复3次，结果显示耐药GIST-T1细胞的甲磺酸伊马替尼半数抑制浓度为(48.4±1.9)μmol/L，高于野生型GIST-T1细胞的(11.2±0.75)μmol/L(t=89.986，P<0.001)。

1.2.2 AG-1024干预对甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞增殖活性的影响:用0.25%的胰蛋白酶消化对数生长期的甲磺酸伊马替尼耐药性GIST-T1细胞，用10%胎牛血清终止消化后，收集细胞以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养基制备单细胞悬液。将细胞浓度调节至5×104个/mL，接种于96孔板(每孔200 μL，含1×104个细胞)，置于37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养12 h后，将细胞分为5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L AG-1024浓度组和对照组(不同AG-1024浓度组采用200 μL二甲亚砜溶解制成相应浓度AG-1024)，对照组添加等体积的二甲亚砜。取l孔作为空白调零孔(加培养基100 μL、四甲基偶氮唑盐10 μL、二甲亚砜100 μL)，每组均设置5个复孔，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中继续培12 h、24 h、48 h后，向每孔加入10 μL四甲基偶氮唑盐溶液(5 mg/mL)，继续培养4～6 h后，弃培养液，每孔加入100 μL二甲亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。以空白孔调零，在酶标仪上检测490 nm波长处的吸光度值，实验重复3次，取平均值。

1.2.3 AG-1024干预对甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞Akt、p-Akt核蛋白表达的影响:取对数生长期的伊马替尼耐药GIST-T1细胞置于24孔板中，将细胞分为AG-1024 12 h组、AG-1024 24 h组、AG-1024 48 h组和对照组，AG-1024干预组加入0.2 μL终浓度为10 μmol/L AG-1024，对照组添加等体积的二甲亚砜。分别干预12 h、24 h、48 h后收集AG-1024干预组(对照组于干预即刻收集细胞)等量细胞(2×105个)，按照细胞核提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：SN0020)说明书操作步骤提取细胞核蛋白。顺序加入裂解缓冲液及试剂乙醇液，冰上研磨细胞；将匀浆转移至1.5 mL EP管，4℃，2 500 r/min离心5 min，收集细胞核沉淀，裂解缓冲液重悬；重悬液加入培养基缓冲液中，4℃，2 500 r/min，离心5 min，收集细胞核沉淀；裂解缓冲液重悬细胞核沉淀，3 000 r/min，离心10 min，收集细胞核沉淀；用适量的Store Buffer重悬细胞核沉淀；最后，加入上样缓冲液裂解细胞核，用Bradford法测定蛋白浓度。以β-肌动蛋白为内参，取50 ng蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，后将蛋白转至硝酸纤维膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗工作液(Akt、p-Akt抗体及β-肌动蛋白抗体稀释度均为1 ∶1 000)，4℃孵育过夜后加入二抗(1 ∶5 000)，室温摇床孵育1.5 h，化学发光、显影、定影后用UVP凝胶图像处理系统LabWorks 4.6软件分析目的条带的灰度值。实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，重复测量资料采用重复测方差分析进行比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 AG-1024对甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞增殖的影响 时间与分组具有交互效应(F交互=58.683,P交互<0.001)；吸光度值有随时间变化的趋势(F时间=102.706，P时间<0.001)，其中各浓度AG-1024组的吸光度值呈下降趋势；4组细胞吸光度值差异具有统计学意义(F组间=124.315，P组间<0.001)，同一时间点，各浓度AG-1024组的吸光度值均低于对照组，且10 μmol/L与20 μmol/L AG-1024组的吸光度值低于5 μmol/L AG-1024组(均P<0.05)，但10 μmol/L与20 μmol/L AG-1024组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。考虑到药物的作用浓度在一定程度上与细胞毒性呈正相关，本实验选用10 μmol/L AG-1024这一浓度进行后续实验。

表1 4组伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞吸光度值的比较(x±s)

2.2 AG-1024对甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞Akt、p-Akt蛋白表达水平的影响 对照组与各AG-1024干预组Akt蛋白表达水平比较差异无统计学意义，且AG-1024干预组不同干预时间点Akt蛋白表达水平比较差异亦无统计学意义(均P>0.05)；各AG-1024干预组p-Akt蛋白表达水平均低于对照组，AG-1024 12 h组、AG-1024 24 h组、AG-1024 48 h组细胞p-Akt蛋白表达水平依次降低(均P<0.05)。见表2和图1。

表2 4组甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞Akt、p-Akt蛋白相对表达水平比较(x±s)

图1 4组甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞Akt和p-Akt蛋白表达情况

3 讨 论

20世纪80年代，Mazur等[5]最早将这种缺乏平滑肌细胞超微结构和神经鞘瘤免疫组织化学特征的非上皮肿瘤称为“胃肠间质瘤”。随着研究的深入，人们逐渐对GIST的发生和发展有了新的认识。Hirota等[6]及Heinrich等[7]分别于1998年及2003年报告了编码酪氨酸激酶的c-kit及PDGFRA-α基因的突变在GIST发生发展过程中的作用,这为GIST的靶向治疗提供了理论依据。

Joensuu等[2]首次采用甲磺酸伊马替尼治疗晚期GIST患者并取得了革命性的成果后，GIST患者的生存率得到显著提高。但继发性耐药始终是困扰实体肿瘤药物治疗的难题，GIST亦不例外。因此，如何解决甲磺酸伊马替尼继发性耐药成为亟待解决的难题。现阶段研究显示，甲磺酸伊马替尼继发性耐药的机制主要c-kit/PDGFRA基因的二次突变改变了c-kit构造，使得甲磺酸伊马替尼的结合位点被隐藏，导致耐药的发生[8]。但临床上近半数的甲磺酸伊马替尼继发耐药的GIST患者并未检测出新的突变位点[9]，提示二次突变理论并不能解释所有的耐药现象，可能存在其他酪氨酸激酶受体的活化而导致甲磺酸伊马替尼继发耐药的发生。

IGF-1R同属于酪氨酸激酶受体，在人类许多恶性肿瘤中存在过表达，其与配体相结合后引发胞内区多个酪氨酸的自我磷酸化，从而激活下游相关信号通路，发挥促进细胞增殖和抗凋亡的作用[10]。本研究结果显示，IGF-1R抑制剂AG-1024能明显抑制甲磺酸伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞的增殖，且随着作用时间的延长其抑制作用增加(P<0.05)，提示在一定浓度范围内AG-1024对甲磺酸伊马替尼继发耐药GIST-T1细胞增殖具有抑制作用，且有一定的时间依赖性。但当AG-1024药物浓度为10 μmol/L和20 μmol/L时，两者对细胞增殖的影响差异无统计学意义(P>0.05)。

黄颖鹏等[11]的研究结果显示，对于甲磺酸伊马替尼继发耐药性的GIST患者，即使无c-kit/PDGFRA二次突变，继发性耐药GIST患者组织标本中仍存在IGF-1R基因及蛋白水平的表达上调，证实IGF-1R介导的信号通路在c-kit/PDGFRA二次突变之外的耐药机制中发挥重要作用，但具体机制尚不清楚。研究表明，Akt蛋白处于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy-linositol 3-kinase，PI3K)/Akt信号通路的中心位置，经磷酸化后被激活形成p-Akt，后者进一步使多个Akt下游蛋白发生磷酸化(包括PI3K)，从而调控肿瘤细胞的增殖与凋亡等[12]。周楠等[13]研究发现，IGF-1R抑制剂NVP-AEW541可以通过失活PI3K/Akt信号通路，下调Akt的磷酸化水平，进而抑制SKOV3-PKH26hi细胞增殖，并促进细胞凋亡。本研究结果显示，经AG-1024干预后，在Akt蛋白表达水平无明显变化前提下，随着干预时间的延长，p-Akt蛋白表达水平逐渐下调(P<0.05)。这提示IGF-1R抑制剂AG-1024可通过抑制甲磺酸伊马替尼继发耐药GIST-T1细胞的PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化，从而起到抑制细胞增殖的作用。

综上所述，AG-1024可抑制伊马替尼继发耐药性GIST-T1细胞的增殖,且呈一定的时间依赖性，抑制PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化可能是其作用机制之一。