荔枝木质精油体外抑菌活性及稳定性研究

董蕾，郑玉玺，韩明，贾强

（广州城市职业学院食品科学与美食养生学院，广东 广州 510640）

植物精油（essential oils，EOs）分子量较小且具一定活性。已有大量研究发现，天然植物精油对常见致病菌均有优异的抑制效果。如程鹏等[1]和陈和平等[2]均发现，薰衣草精油对单核细胞增多性李斯特菌、沙门氏菌等食物传播性致病菌具很强的抗菌活性，TASSON等[3]发现薄荷精油对肠炎沙门氏菌和单核细胞扩增李斯特菌具有抑制效果。随后，研究者发现长豆角核[3]、丁香精油[4-5]、荔枝果核[6]、生姜、蒜、葱、胡椒等香辛料[7]提取的多种精油均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、大肠埃希氏菌[8]等有优异的杀菌、抗菌效果。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是我国南方重要的经济树种之一。以往对荔枝精油的研究，主要集中于荔枝果实[10-12]。而荔枝木每年经轮植、修建所获木材数量巨大，废弃处理造成资源浪费。在前期研究中，已成功利用蒸馏法提取荔枝木质精油，并对荔枝木质精油的成分进行气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析，发现烯类化合物为荔枝木质精油中的主要挥发成分，占55.67%[13]。目前对荔枝精油特别是木质精油的抑菌和抗氧化研究还未见报道。本研究对前期自行提取的荔枝木质精油的抑菌抗菌性能及抗氧化性能进行分析，为荔枝木质精油的日化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 荔枝木质精油

于2019年5月在广东省高州市石鼓镇采集约30年树龄的妃子笑荔枝树干，以韩明等[13]方法进行荔枝木质精油的提取。精油得率为0.71 mL/100 g。

1.1.2 供试菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）标准菌株ATCC25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）标准菌株ATCC6538、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）标准菌株ATCC6633、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）标准菌株ATCC19115、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）标准菌株 ATCC14028：美国典型菌株保藏中心；肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）标准菌株 CMCC（B）50335、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi β）标准菌株 CMCC（B）50094：中国医学细菌菌种保藏管理中心；黑曲霉（Aspergillus niger）FSCC114001、桔青霉（Penicillium chrysogenum）FSCC197001、黄曲霉（Aspergillus flavus）AS3.3554：广东省微生物研究所。

1.1.3 主要试剂

营养琼脂（nutrient agar，NA）、营养肉汤（nutrient broth，NB）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：广东环凯微生物科技有限公司；NaOH、柠檬酸（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国Sigma公司。

1.1.4 仪器与设备

LDZX-40AI立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DH5000AB型电热恒温培养箱：天津泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及菌悬液制备

细菌置于37℃24 h活化；霉菌置于28℃48 h活化。根据陈林林等[8]方法，在超净工作台上挑取适量活化细菌、霉菌到9 mL无菌水试管中，充分混合后，吸取1 mL混合菌悬液于另一支9 mL无菌水试管中，依次制备成梯度浓度的菌悬液。采用平板计数法（细菌）或显微镜直接计数法（霉菌）进行计数，并根据结果将菌悬液浓度调至106CFU/mL～107CFU/mL。

1.2.2 抑菌活性研究

1.2.2.1 抑菌圈测定

以牛津杯法测定抑菌圈直径[14]。吸取100 μL菌悬液均匀涂布于培养基表面（细菌为营养琼脂培养基、霉菌为PDA培养基），超净工作台上使用6 mm×10 mm无菌不锈钢圆管在琼脂上打孔，挑掉孔内培养基，并用琼脂进行封底。吸取100 μL荔枝木质精油原液，加入打好的孔中，4℃下2 h预扩散，而后30℃孵育24 h。DMSO为阴性对照。抑菌圈直径的测定利用游标卡尺，以十字交叉法进行测量。每组进行3次重复。

抑菌圈直径>15 mm为最敏感、10 mm～15 mm为中度敏感、7 mm～9 mm为低度敏感，无抑菌圈为不敏感[15]。

1.2.2.2 最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）测定

MIC和MBC以气相扩散法[16-17]测定。将精油通过0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，吸取128 μL溶于1 mL DMSO中，制成128 μL/mL的精油溶液。在9 cm培养皿中分别加入营养肉汤培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将100 μL 106CFU/mL各菌悬液均匀涂抹至吸收。用移液枪吸取 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mL 精油溶液在皿盖中央，使培养皿中精油含量为 1.25、2.5、5、10、20、40、80 μL/mL（9 cm 培养皿中体积约为 100 mL）。以不添加精油的培养皿为空白对照。快速密封培养皿，细菌于36℃培养20 h，霉菌于28℃培养5 d。以完全无菌生长的最小精油浓度为该菌的MIC。无菌条件下，将无菌生长的培养皿皿盖替换成无精油添加的灭菌皿盖，再继续培养。以再次培养仍然无菌生长的精油浓度为该菌的MBC。

1.3 荔枝木质精油稳定性

1.3.1 不同pH值对荔枝木质精油抑菌效果的影响

以2%NaOH和50%柠檬酸分别调节pH值达到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，并以各 pH 值精油溶液进行抑菌圈测定。

1.3.2 不同温度对荔枝木质精油抑菌效果的影响

将制备好的荔枝木质精油原液分别置于40、60、80、100、120℃下进行热处理20 min，再冷却至室温（25℃），进行抑菌圈测定。

1.3.3 紫外照射对荔枝木质精油抑菌效果的影响

将荔枝木质精油置于紫外灯（辐照强度70μW/cm2）下处理 10、20、30、40 min 后，进行抑菌圈测定。

2 结果与讨论

2.1 荔枝木质精油抑菌活性

荔枝木质精油对不同细菌和霉菌的抑菌活性见表1。

表1 荔枝木质精油对不同细菌和霉菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil against bacteria and fungi

如表1所示，抑菌圈与MIC测定结果均表明，荔枝木质精油对枯草芽孢杆菌体外抑菌效果最优，抑菌圈达到（16.94±0.44）mm，MIC 为 2.5 μL/mL，这可能是由于枯草芽孢杆菌在精油胁迫环境下迅速形成芽孢，进入休眠状态，形成较大抑菌圈。同时，荔枝木质精油表现出对受试革兰氏阳性菌的抑菌效果普遍优于革兰氏阴性菌，这可能是由于革兰氏阴性菌细胞壁外侧的脂多糖成分能够阻止疏水化合物进入微生物体内，因此抑菌效果较差[18]。荔枝木质精油对霉菌也具有较好的抑菌性，这可能是由于精油导致霉菌孢子形态结构受损、破坏霉菌细胞膜和细胞壁，影响了霉菌的正常生长[19]。

2.2 pH值对荔枝木质精油抑菌效果的影响

不同pH值条件下荔枝木质精油抑菌效果的影响见图1。

图1 不同pH值条件下荔枝木质精油的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different pH

如图1所示，不同pH值对荔枝木质精油的抑菌性能有显著影响。受试菌在酸性荔枝木质精油环境下的抑菌性能均有所提升。这可能是由于酸性条件本身抑制微生物生长，同时酸性环境也降低了精油中酚类化合物的酚羟基电离度，增加其疏水性，使精油更易与细菌细胞膜的蛋白质结合[20]，协同增强了荔枝木质精油的抑菌性。

2.3 温度对荔枝木质精油抑菌效果的影响

温度对荔枝木质精油抑菌效果的影响见图2。

图2 不同热处理条件下荔枝木质精油的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different temperature

如图2所示，在荔枝木质精油被加热到60℃～80℃时，对受试细菌和霉菌有较好的抑菌效果，随着加热温度提高，抑菌效果出现下降。这可能是由于精油中的挥发性抑菌成分受热挥发，影响其抑菌效果。但在高于100℃时，荔枝木质精油对受试细菌和霉菌均仍有较好抑菌效果。

2.4 紫外照射对荔枝木质精油抑菌效果的影响

紫外照射处理不同时间后，荔枝木质精油对受试细菌和霉菌的抑菌效果见图3。

图3 不同紫外照射时间下荔枝木质精油的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different ultraviolet ray irradiate time

如图3所示，紫外照射处理对荔枝木质精油的抑菌效果无太大影响，这表明荔枝木质精油的紫外稳定性较好，其抑菌成分不受紫外线影响，因此可应用于食品的辐射保鲜中[21-22]。

3 结论

荔枝木质精油对7种常见食源性致病菌和3种霉菌均具有良好的抑菌效果，其中对细菌的抑菌效果优于霉菌；革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，尤其对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的MIC可以达到5 μL/mL。在稳定性方面，荔枝木质精油具有良好的紫外稳定性；温度和pH值对荔枝木质精油的抑菌效果有影响。温度低于100℃时，抑菌效果无显著影响，高于100℃时，抑菌效果有所下降，但仍具有一定的抑菌效果；酸性条件增强了荔枝木质精油精油的抑菌活性。