NSCLC组织中Ape1/Ref-1及microRNA-21表达与预后关系

张海燕 冯平 张洪艳 杨雅婷 路云涛

肺癌根据病理形态可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中后者占比80%［1］。由于早期症状不明显，多数患者确诊时已进展至晚期，预后较差［2］。临床常用基于铂类药物的一线化疗方案，有效率仅有40%左右，多数患者无法从中获益［3］。为了改善患者生存质量，应根据患者对化疗的反应修整治疗方案，以获取最佳疗效［4］。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1（apurinic/apyrimidinicendonuclease/redoxfactor-1，APE/Ref-1）是一种功能性蛋白，通过调控核转录因子氧化还原而影响细胞增殖。既往研究显示，Ape1/Ref-1 在许多恶性肿瘤中高度表达且影响预后，可能与化疗耐药性有关［5］。微小RNA-21（microRNA-21）为非编码短链RNA，研究证实其表达变化在恶性肿瘤的不同发展阶段有所差异［6］。目前关于microR-NA-21 与NSCLC 化疗患者预后关系的报道较少。本研究旨在探讨二者在NSCLC 组织中表达与化疗疗效及预后的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2015年10月至2017年10月期间本院78例晚期NSCLC 化疗患者组织及癌旁组织。纳入标准：①符合NSCLC 诊断标准［7］并经及病理组织学确诊；②均接受NSCLC 标准一线化疗方案；③临床资料完整。排除标准：①妊娠期、哺乳期女性；②有化疗禁忌症者；③随访资料不完整者。其中男46 例，女32 例；年龄，平均（57.62±11.35）岁；鳞癌47 例，腺癌31 例。本研究在医院伦理委员会批准下开展，患者均签署知情同意书。

1.2 治疗方法

第1～4 d，予以顺铂注射液（江苏豪森药业；H20040813）20 mg/m3/d 静滴，21 d 为一个治疗周期，治疗两个周期后评估疗效。

1.3 检测方法

收集患者癌灶组织及其对应距病灶3 cm 的癌旁组织标本，部分标本常规固定并经石蜡包埋切片，用于免疫组织化学分析，其他标本迅速保存于液氮中，用于RNA 提取。

1.3.1 Ape1/Ref-1 表达检测

鼠抗人Ape1 单克隆抗体购自美国Novus Bio-logicals，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。400 倍镜下，避开坏死区，取10 个视野。染色强度：淡黄色计1 分，黄色计2 分，棕黄色计3 分。阳性细胞数［8］：0 分，1 分，2 分，3 分，4分。染色强度与阳性细胞数计相加，1 分为-，2～3分为+，4～5 分为++，6～7 分为+++，记-、+为低表达，++、+++为高表达。

1.3.2 microRNA-21 表达检测

制备组织匀浆，加入TRIZOL 试剂（美国Sig-ma-Aldrich），Taqman microRNA 逆转录试剂盒（美国ABI）进行逆转录，得到的cDNA 样本采用Taq-man Universal PCR master Mix 试剂盒（美国ABI）扩增。microRNA-21 表达量采用2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmicroRNA-21-Ct内参。以癌灶组织microRNA-21表达量/癌旁组织microRNA-21 表达量<2 为mi-croRNA-21 低表达，癌灶组织microRNA-21 表达量/癌旁组织microRNA-21 表达量≥2 为microR-NA-21 高表达［9］。

1.4 疗效评估［10］

完全缓解（complete response，CR）；部分缓解（partial response，PR）；疾病稳定（stable disease，SD）；疾病进展（progressive disease，PD）。以（CR+PR）为有效，根据治疗效果将患者分为有效组、无效组。

1.5 观察指标

比较各组Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达水平，采用Spearman 相关性分析化疗疗效与癌灶组织Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达水平的相关性，采用生存曲线分析总生存期（overall survival，OS）与癌灶组织Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达的相关性。

1.6 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料采用（）表示，采用独立t检验；计数资料采用n（%）表示，采用χ2检验；采用spearman 秩相关系数进行相关性分析，Kaplan-Meier 法进行单因素生存分析，COX 回归模型进行多因素生存分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌灶组织与癌旁组织Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达比较

癌灶组织Ape1/Ref-1 高表达率及microRNA-21 相对表达量均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 癌灶组织与癌旁组织Ape1/Ref-1，microRNA-21 表达比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of Ape1/Ref-1、microRNA-21 between cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

表1 癌灶组织与癌旁组织Ape1/Ref-1，microRNA-21 表达比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of Ape1/Ref-1、microRNA-21 between cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

组别癌灶组织癌旁组织χ2值P 值-+2（2.56）13（16.67）4（5.13）22（28.21）++52（66.67）39（50.00）+++20（25.64）4（5.13）5.656<0.001高表达72（92.31）43（55.13）27.825<0.001 microRNA-21 相对表达量4.65±1.27 2.49±1.62 9.267<0.001

2.2 有效组、无效组癌灶组织Ape1/Ref-1、mi-croRNA-21 表达比较

有效组癌灶组织Ape1/Ref-1、microRNA-21 高表达率均低于无效组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2、图1。

表2 有效组、无效组癌灶组织Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达比较［n（%）］Table 2 Comparison of Ape1/Ref-1、microRNA-21 expression in cancer tissues between effective group and ineffective group［n（%）］

图1 癌灶组织免疫组化染色结果示意图（SP，×400）Figure 1 Schematic diagrams in cancer tissues by immunohistochemical staining（SP，×400）

2.3 化疗疗效与Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达相关性分析

Spearman 相关性分析显示，化疗疗效与癌灶组织Ape1/Ref-1（r=-0.615）、microRNA-21（r=-0.492）表达均呈负相关性（P<0.05）。

2.4 化预后与Ape1/Ref-1、microRNA-21 表达相关性分析

COX多因素分析显示，癌灶组织Ape1/Ref-1、mi-croRNA-21 表达是影响NSCLC 患者生存率的独立相关因素（P<0.05）。Ape1/Ref-1 低表达者3年生存率（50.00%）高于高表达者（19.44%），microR-NA-21 低表达者3年生存率（32.61%）高于高表达者（9.38%），差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3、图2。

表3 NSCLC 预后的COX 多因素回归分析Table 3 Cox multivariate regression analysis of prognosis of NSCLC

图2 Ape1/Ref-1、microRNA-21 不同表达患者生存曲线Figure 2 survival curves of patients with different expression of Ape1/Ref-1 and microRNA-21

3 讨论

尽管近年来肺癌的早期诊断和治疗取得了明显进展，但仍有多数患者确诊时已进展至晚期。早期肿瘤虽可行手术完全切除，但仍有约半数术后出现复发或转移，预后较差［11］。

NSCLC 的治疗中，化疗起着重要作用，对于失去手术切除机会的晚期NSCLC 患者，以铂类为基础的化疗仍是一线治疗方案。研究证实，化疗可延长NSCLC 患者生存期，但化疗耐药也是造成病情进展的重要因素［12］。近年来针对肿瘤细胞耐药性机制的研究很多，但仍缺乏可预测、评估NSCLC 化疗疗效的有效且简便的生物学指标［13］。Ape1/Ref-1是具有多重功能的DNA 碱基切除修复限速酶，在细胞损伤修复中发挥重要作用，同时也是氧化还原因子，具有调节细胞内核转录因子表达的作用。根据既往研究，Ape1/Ref-1 的过表达可增强生殖细胞瘤、脑胶质瘤对放疗的抗性［14］。Spearman 相关性分析显示，化疗疗效与癌灶组织Ape1/Ref-1 表达呈负相关。分析其可能机制，目前认为主要是由于Ape1/Ref-1 的过表达伴随DNA 内切酶活性增强，进而导致化疗耐药；同时，Ape1/Ref-1 的结构决定其可调控多种核转录因子的表达，这在化疗耐药中发挥更大作用［15］。癌灶组织Ape1/Ref-1 的表达与NSCLC 化疗患者预后生存期密切相关，表明Ape1/Ref-1 可作为评估预后的重要参考指标。

microRNA 是一种单链非编码RNA，可调控转录后水平基因表达，其中microRNA-21 是目前研究最为广泛的一种［16］。在既往研究中可见相似结论［17］，提示NSCLC 的发生伴随microRNA-21 的上调，且microRNA-21 的表达与化疗疗效密切相关。一方面，microRNA-21 对抑癌基因的表达具有抑制作用；另一方面，microRNA-21 通过调控蛋白酪氨酸磷酸酶基因（protein tyrosine phosphatase gene，PTEN）导致的化疗耐药，使肿瘤细胞顺铂类药物耐药性显著增强，进而影响化疗疗效。进一步的COX 多因素分析表明，NSCLC 的预后与microRNA-21 表达密切相关，表明NSCLC 组织中microRNA-21 表达可作为预后生存的预测指标。

综上所述，NSCLC患者癌灶组织中Ape1/Ref-1、microRNA-21 的表达与化疗疗效及预后密切相关，可为NSCLC 患者预后预测提供参考，其介导化疗耐药的更多机制，尚需进一步研究探讨。