侯智勇,刘阳
(四川旅游学院,成都 610100)
酱香在我国已有上千年历史,因其香味独特、应用广泛、独具魅力而受到大众喜爱,同时其产香机理及风味成分复杂,使得众多研究者致力于酱香风味成分的研究[1-4]。对于产酱香微生物已有些报道,许多研究结果显示芽孢杆菌与产酱香风味关联度比较大[5-6],这些微生物的代谢活动与发酵过程中物理化学反应的相互重迭作用,最终形成了酱香型白酒中一系列特殊的风味物质[7]。高温大曲中的微生物对酱香风味的形成尤为重要。罗建超等[8]曾从茅台酒的大曲中分离出产酱香芽孢杆菌并初步探析其代谢产香;黄永光等[9]也从酱香型白酒生产制曲、堆积酒醅和发酵期酒醅中分离出地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌,并详述了三类产香芽孢杆菌发酵代谢产香的特征性成分、特征性酶、产香过程风味的特征性变化和群体微生物发酵机制。可见,对高温大曲中微生物的研究,特别是芽孢杆菌的深入研究分析,有利于揭示酱香的形成机制。
本研究从酱香型白酒大曲中分离得到产酱香风味的菌株,分析其发酵过程中的代谢产物,跟踪检测代谢过程中总酸、氨基酸态氮、还原糖的变化过程,并应用固相微萃取及气质联用技术检测其发酵后的挥发性物质,进而对产酱香芽孢杆菌的代谢产物进行研究,为找出酱香的主体香分提供了参考。
1.1.1 菌种来源
实验菌株:产酱香芽孢杆菌(从四川某酒厂产酱香高温大曲中筛得)。
1.1.2 主要仪器
SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;QYC-2102C型摇床 上海福玛实验设备有限公司;LRH-250型生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;6890N-5979B型气相色谱仪 美国安捷伦公司。
1.1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基:蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、琼脂22 g/L,pH 7.0~7.2,121 ℃,0.1 MPa,灭菌30 min。
发酵培养基:小麦150 g,一半打碎,另一半完整混匀后于150 mL蒸馏水中煮25 min,以100 g重量分装于锥形瓶中,121 ℃灭菌30 min。
1.2.1 菌种活化
采用无菌操作将3株纯种菌株分别接种在斜面培养基上,37 ℃培养24 h,备用。
1.2.2 产酱香菌株固体发酵
用无菌生理盐水制成菌悬液,以2%接种量加入至发酵培养基中,共计3组平行实验。每隔24 h观察发酵情况,待发酵144 h完成后,对每个菌株产酱香情况做感官鉴定,根据产香能力分为:无、+、++、+++、 ++++ 5个等级,检查培养基的产香情况、褐变情况以及培养基粘性,并做好记录。
1.2.3 总酸含量的测定[10]
1.2.3.1 测定方法
分别取发酵时间24,48,72,96,120,144 h的样品10.0 g于研钵中,加入10.0 mL蒸馏水研磨均匀,定容后过滤,用氢氧化钠标准液滴定,记下消耗氢氧化钠标准液的体积,计算总酸含量。
1.2.3.2 结果计算
总酸度/(mol/mL)=(c×V×K)/V0。
式中:c为氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/mL;V为滴定所消耗的标准碱液的体积,mL;V0为滴定时吸取的样液体积,mL;K为换算系数。
1.2.4 氨基酸态氮的测定1.2.4.1 测定方法
采用甲醛法检测样品中的氨基酸态氮,根据消耗氢氧化钠标准液的量,计算出氨基酸态氮含量。
1.2.4.2 结果计算
氨基酸态氮/%=[(V1-V2)×c×0.014×100]/(m×10/100)。
式中:V1为稀释液在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氢氧化钠标准溶液的体积;V2为空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氢氧化钠标准溶液的体积;c为氢氧化钠标准溶液的浓度;m为样品的质量;0.014为氮的毫摩尔质量。
1.2.5 还原糖的测定[11]
1.2.5.1 样品处理
分别取发酵时间24,48,72,96,120,144 h的样品10.0 g,加入100 mL蒸馏水,搅拌20 min,静置10 min,取上清液即为样品液。
1.2.5.2 试样测定
采用斐林试剂鉴定还原糖的方法,直接滴定样品中的还原糖,直至蓝色刚好褪去为终点,记录样液消耗体积,同法平行操作3份,得出平均消耗体积。
1.2.5.3 结果计算
η/%=250M2/(V0×V×1000)。
式中:η为样品中还原糖的含量(以葡萄糖计);M2为10 mL碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各5 mL)相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量;V0为样品体积;V为测定时平均消耗样品溶液体积;250为样品溶液总体积。
1.2.6 GC-MS检测发酵产物[12]
1.2.6.1 样品预处理
分别取未接种菌株的空白发酵培养基、3种菌株各自发酵完成后的样品5 g于顶空瓶中平衡10 min后吸附20 min,将萃取头移入气相色谱的高温汽化室中解吸5 min,进行GC-MS分析。
1.2.6.2 GC-MS条件
色谱、质谱条件以及定性与定量分析方法参照《柑橘果皮中生香酵母的筛选及挥发性香气成分分析》中的检测条件和方法。
发酵后观察小麦固体发酵培养基褐变、粘稠情况以及生香情况,前48 h有猪肉香味,略带氨味,到72 h有微弱的酱香味,氨气味消失,到96 h酱香味更突出,到120 h酱香味非常突出,144 h后酱香味浓郁,见表1。
表1 各菌株发酵144 h后培养基特征与产酱香情况
本次实验采用食品中总酸测定的普遍方法,即电位滴定法作为样品总酸测定的方法,计算总酸的含量,结果见图1。
图1 发酵过程中总酸的变化
由图1可知,随着发酵时间的增加,总酸含量也在不断增加,且都在发酵72 h后总酸突然增大,发酵后期总酸增速小,基本平稳略呈下降趋势。分析此变化过程,芽孢杆菌在发酵过程中产生大量有机酸,致使发酵产物中总酸含量增加,尤其在发酵第3天,发酵温度升高后明显增加,发酵后期一些碱性物质的生成导致总酸增速放慢,酸度有所下降。有研究表明,产酱香芽孢杆菌通常在高温下能更好地产香,其与美拉德反应有关,而产酱香芽孢杆菌的酸度突然增加也在发酵温度升高时,与生香情况一致。因此,酸度的变化与酱香的生香情况可能有密切关联。
氨基酸态氮含量的测定采用甲醛法,通过计算可得到样品中氨基酸态氮的含量,结果见图2。
图2 发酵过程中氨基酸态氮的变化
由图2可知,随着发酵时间的增加,氨基酸态氮含量不断增加,芽孢杆菌发酵产蛋白酶,蛋白酶能将蛋白质水解为氨基酸,随着发酵时间的推移,氨基酸态氮含量持续上升。在发酵过程中,蛋白质分解速度与酶的活力、蛋白质含量有密切关系,至发酵结束时氨基酸态氮含量达到最大。氨基酸态氮含量变化体现了游离氨基酸含量的逐渐增加,而游离氨基酸的含量与酱香食品的风味密切相关。
用直接滴定法测定食品中还原糖的含量,结果见图3。
图3 发酵过程中还原糖的变化
由图3可知,随着发酵时间的增加,还原糖的含量在不断减少,期间,芽孢杆菌将还原糖分解利用供其生长繁殖,最终发酵样品中的还原糖经过呼吸作用被全部分解利用,而经过微生物的糖代谢途径,更易产生多种中间代谢产物及最终代谢产物,进而为酱香风味提供了支撑。
分别检测未接种菌株的空白发酵培养基、3种菌株各自发酵144 h后的挥发性物质,得到各样品的总离子流图谱,见图4~图7。对总离子流图中各数据进行分析,得到各样品中挥发性香气成分及相对含量,见表2。
图4 空白组香气成分图谱
图5 Q1香气成分图谱
图6 Q2香气成分图谱
图7 Q5香气成分图谱
表2 4种样品挥发性香气成分
由表2可知,3株菌株产挥发性物质有相同的,也有各自独特的。Q1产挥发性物质最多,达到12种,Q2为9种,Q5为10种。Q1吡嗪相对含量为43.18%,Q2吡嗪相对含量为50.46%,Q5吡嗪相对含量为45.96%,且Q1、Q2 产生的2,3,5,6-四甲基吡嗪相对含量较高,而Q5产生的2,5-二甲基吡嗪相对含量较高。吡嗪含量高低以及所含种类差异是导致所产酱香味不同的原因。
酱香型白酒的主体香气成分一直是白酒行业的研究热点,到目前为止,关于酱香型白酒的特征香气成分在学术界仍没有定论。酱香主体香成分的不确定使得研究思路从源头上被限制了。因此,从产酱香细菌的角度来看,分析酱香型白酒的主要呈香物质及其形成机制值得进一步深入研究。
本文以小麦为发酵培养基,跟踪检测3株产酱香菌株在发酵过程中总酸、氨基酸态氮、还原糖的变化,得到其总酸含量是一个先增后降的变化过程,氨基酸态氮是一个连续增加的过程,而还原糖则是一个连续降低的过程。用固相微萃取及气质联用法检测3株菌株发酵后的挥发性物质,结果显示:其均有高含量、种类不同的吡嗪,以此可为确定产酱香主体成分提供参考。