中国蓝舌病病毒血清15 型毒株的全基因组测序与进化分析*

李占鸿，杨振兴，朱建波，肖 雷，李 乐，廖德芳，李华春，杨 恒

(云南省畜牧兽医科学院 热带亚热带动物病毒重点实验室，云南 昆明 650224)

蓝舌病(bluetongue，BT)是蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)感染牛、羊等动物引起的一种严重侵害反刍动物的烈性出血性传染病，主要流行于热带、亚热带及温带地区。病毒主要通过雌性库蠓(Culicoidesspp.)对牛、羊和骆驼等反刍动物的吸血性叮咬进行传播[1]。BT 的爆发和流行给牛羊养殖业造成严重的经济损失，导致牛羊出口贸易受限，影响畜产品正常国际贸易，据估计全球每年导致的经济损失高达30 亿美元[2]。世界动物卫生组织(OIE)将BT 列为法定报告的动物疫病，中国也将本病列为一类动物疫病。

BTV 隶属呼肠病毒科(Reoviridae) 环状病毒属(Orbivirus)，病毒基因组大小约20 kb，由10个基因节段(Seg-1～Seg-10) 的双链RNA (double strand RNA，dsRNA) 构成，可编码VP1～VP7 等7 种结构蛋白以及NS1、NS2、NS3、NS3a 和NS4 等5 种非结构蛋白[3-4]。BTV 的内部核心由RNA 依赖的RNA 聚合酶(VP1)、加帽酶(VP4)、解旋酶(VP6)与基因组dsRNA 组成[5]，内层衣壳由Seg-3 与Seg-7 编码的VP3 与VP7 蛋白共同构成，虽然VP3 与VP7 蛋白具有高度保守的特性，但Seg3 与Seg7 核酸序列在不同地域分离的BTV 毒株间却存在着变异，并可据此将BTV 分为东方型毒株(Eastern) 与西方型毒株(Western)两种地域型[6]。BTV 的外层衣壳由Seg-2 与Seg-6 编码的VP2 与VP5 蛋白构成，其中VP2 蛋白是诱导机体产生中和抗体的蛋白，决定着BTV的血清型[7]。BTV 的Seg-2/VP2 与Seg-6/VP5 具有丰富的遗传多样性，目前世界范围报道了27种血清型BTV (BTV-1～BTV-27)[8-10]。BTV 血清型众多，不同血清型毒株之间缺乏交叉免疫保护，给疫病的防控带来了严峻的挑战[11]。

BTV-15 型流行于非洲、中东地区、澳大利亚与中国。澳大利亚流行BTV-15 型毒株的全基因组测序结果显示其Seg-3 与Seg-4 构成了一个独立的地域型：远东型(Far-eastern)，提示BTV-15型毒株在进化上的独特性[12]。本实验室在1996—1997 年从中国云南省分离到BTV-15 型毒株，但对毒株遗传背景的掌握仅限于Seg-2 与Seg-10 基因节段[13-14]。基因组序列信息的缺乏，限制了对流行于中国的BTV-15 型毒株的起源与病毒基因重配等关键信息的掌握。为分析中国BTV-15 型毒株的进化特征以及与世界范围BTV-15 型毒株之间的关系，本研究采用全长cDNA 扩增技术(full length cDNA application，FLAC)[15]与高通量测序技术(next generation sequencing，NGS)对中国1996 年分离的BTV-15 型毒株B105/YN/1996进行全基因组扩增与测序，研究结果可为掌握中国BTV 的演化和诊断试剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与毒株

BHK-21 细胞(仓鼠肾细胞) 由本实验室保存。B105/YN/1996 毒株于1996 年分离自云南省普洱市的哨兵牛(sentinel cattle)，通过血清中和试验鉴定病毒为BTV-15 型。

1.2 引物

用于与dsRNA 5′ 末端磷酸基团连接的锚定引 物：5 ′-GACCTCTGAGGATTCTAAAC/iSp9/TCCAGTTTAGAATCC-3′ 和dsRNA 病毒全基因组PCR 扩增引物5-15-1：5′-GAGGGATC CAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC-3′ 均参照MAAN 等[15]报道的序列，由上海生物工程有限公司合成。

1.3 RNA 的提取

将病毒接种于75 cm2细胞瓶中生长为单层的BHK-21 细胞，待细胞出现完全细胞病变后收集细胞沉淀，使用RNA 提取试剂RNAiso-Plus(大连宝生物公司)按操作说明提取细胞总RNA，取5 μL 总RNA 以1.5% 的琼脂糖凝胶进行电泳观察。

1.4 病毒基因组dsRNA 的纯化

为获取高纯度的病毒基因组dsRNA，采用核糖核酸酶S1 (大连宝生物公司) 降解的方式除去宿主细胞的单链RNA (single strand RNA,ssRNA)，方法为：以90 μL 水溶解提取核酸，在提取的总RNA 加入核糖核酸酶S1 Buffer 10 μL 和核糖核酸酶S1 (180 U/μL) 2 μL，于37 ℃保温30 min，随后使用Monarch RNA Cleanup Kit 纯化试剂盒(NEB 公司) 参照说明书进行核酸纯化，取5 μL纯化后的病毒基因组dsRNA 以1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳观察。

1.5 病毒基因组的扩增

取10 μL 纯化后的病毒基因组dsRNA，参照MAAN 等[15]报道的FLAC 技术进行病毒全基因组cDNA 合成。取5 μL 完成变性与复性处理的cDNA 为模板，使用高保真DNA 聚合酶(大连宝生物公司)按说明书推荐的反应体系进行PCR扩增。PCR 扩增程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，68 ℃延伸4 min，30 个循环。反应结束后，取5 μL PCR 扩增产物电泳检测dsRNA 病毒基因组扩增的完整程度。

1.6 NGS 测序

使用DNA 纯化试剂盒 (大连宝生物公司)对扩增的BTV 基因组DNA 产物进行纯化。使用Illumina 公司TruSeq DNA Sample Prep Kit v2 DNA文库构建试剂盒进行文库的构建(150 bp)，将构建的文库在Illumina HiSeq 2500 测序平台上进行测序。使用Trimmomatic 软件和FastQC 软件[16]对获取的原始数据进行质量控制与滤过处理(Q＞20)，使用Cap3 软件[17]、PRICE (v140408)软件[18]以及IGV 软件(v2.3.34)[19]对滤过后的测序最小单位(读长，reads) 进行从头组装(de nove)，获得B105/YN/1996 毒株完整基因组的Seg-1～Seg-10基因节段。

1.7 病毒的序列分析与系统发生树构建

使用NCBI 网站中的在线ORF 分析软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析B105/YN/1996 毒株各个基因节段编码氨基酸序列，使用BLAST 软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析B105/YN/1996 与世界范围BTV 毒株核酸和氨基酸序列的相似度。使用MAFFT[20]进行核酸序列的比对，采用MEGA X 软件以邻近法[21]进行系统发生树的构建，选择的参数为p-distance，自举检验值(bootstraps)取值为1 000。

2 结果与分析

2.1 病毒基因组dsRNA 的提取与纯化

由图1a 可知：从病毒感染细胞中提取的BTV 基因组dsRNA 含有大量的宿主ssRNA 短片段，经核糖核酸酶S1 处理后有效提高了提取BTV 基因组dsRNA 的纯度，同时BTV 基因组dsRNA 仍保持良好的完整型，为采用FLAC 技术进行BTV 全基因组的RT-PCR 扩增提供了基础。

2.2 病毒的全基因组扩增与NGS 测序

通过FLAC 技术在1 个PCR 反应中完成了B105/YN/1996 毒株全基因组扩增，电泳结果(图1b)显示：各基因节段PCR 产物的大小在0.8～4 kb。将纯化后的全基因组PCR 产物在Illumina Hiseq 2500 平台上进行NGS 测序与测序结果的de nove拼接，共获取11 832 636 条reads，通过数据过滤处理后得到了10 729 401 条 reads (Q＞20)，其中99.98% 的reads 被进一步组装形成了10 个重叠群(contigs)，每个contigs 上单碱基位点的平均测序深度均大于5 000×，表明成功对B105/YN/1996 毒株基因组进行深度测序。

图1 BTV dsRNA 及全基因组扩增产物电泳Fig.1 Electrophoresis of the BTV dsRNA and complete genome amplification product

2.3 基因组序列特征分析

获取的B105/YN/1996 毒株基因组序列全长为19 154 bp，10 个基因节段的G+C 含量在42.37%～48.96%，长度在822 bp (Seg-10)～3 944 bp(Seg-1)之间，编码蛋白的氨基酸残基数在216(NS3a)～1 302 (VP1)之间。非编码区(non-coding regions，NCR) 占基因组的4.07%，各基因节段5′端NCR 的长度在8 bp (Seg-4)～34 bp (Seg-5)之间，3′ UTR 的长度均大于5′端UTR，其长度在24 bp (Seg-1)～133 bp (Seg-10)之间，各个节段的5′ 与3′ NCR 区均具有5′-GUUAAAA…….ACACUUAC-3′的保守序列(表1)，并具有环状病毒属末端特有的5′-GU…….UAC-3′序列特征[22]。BLAST 比对分析结果显示：BTV-15B105/YN/1996毒株与澳大利亚的BTV-15 型毒株、印度毒株BTV-1 型以及中国BTV-4 和BTV-15 型毒株具有最近的亲缘关系，各基因节段的核酸与编码氨基酸序列相似度在90.17%/94.54% (Seg-2/VP2)～99.90%/99.43% (Seg-7/VP7)之间(表2)。

表1 B105/YN1996 毒株基因组与编码蛋白的特征Tab.1 Characteristics of B105/YN1996 genome segments and their encoded proteins

表2 B105/YN1996 毒株全基因组序列BLAST 分析Tab.2 Sequence comparisons of B105/YN1996 genome by BLAST analyses

2.4 中国BTV-15 型毒株的Seg-2 与Seg-6 系统发生树分析

B105/YN/1996 与BTV-15 型参考毒株(BTV-15/RSArrrr) Seg2/VP2 序列相似度为74.2%/81.1%，而与其他血清型参考毒株的序列相似度最高仅为52.2%/45.4%。根据Seg-2 序列构建的系统发生树显示：27 种血清型BTV 的Seg-2 分为A～L 等12 种基因型，其中BTV-15 型毒株构成独立的基因J 型(图2a)，与其他基因型BTV 的Seg-2/VP2 序列相似度在41.7%/26.1% (基因C 型)～52.2%/45.4%(基因G 型)之间。在系统发生树上，中国与澳大利亚毒株BTV-15 型毒株的Seg-2 聚为东方型，Seg-2/VP2 序列相似度最高为88.5%/94.5%，与非洲与以色列等西方型毒株之间最高仅为74.2%/81.1% (图2a)。

BTV Seg-6 序列构建的系统发生树(图2b)表明：27 种血清型BTV 的Seg-6 可分为A～I 等9 种基因型，其中BTV-15 型毒株的Seg-6 构成了独立的F 基因型，与其他血清型参考毒株的核酸序列相似度在57.4%～96.7%，VP5 氨基酸序列相似度在55.9%～99.2%。与Seg-2 系统发生树上观察到的结果类似，世界范围BTV-15 型的Seg-6 可分为东方与西方两种地域型。中国与澳大利亚BTV-15 型毒株聚为东方型，Seg-6 序列相似度为90.6%与96.7%，VP5 序列相似度为98.2%与99.2%；与西方型的非洲和以色列BTV-15 毒株的Seg-6 核酸序列相似度在80.1%～80.4%，VP5氨基酸序列相似度在95.6%～96.2%。

2.5 中国BTV-15 型毒株的Seg-3 与Seg-4 系统发生树分析

中国BTV-15 型B105/YN/1996 毒株的Seg-3/VP3 与澳大利亚的BTV-15 型毒株具有最近的亲缘关系，序列相似度分别为90.5%/98.5%与97.3%/99.3%，与中东、非洲BTV-15 毒株核酸相似度在79.3%～79.8%，氨基酸序列相似度在96.6%～96.8%。在系统发生树上，中国分离的BTV-1、BTV-2、BTV-4、BTV-12、BTV-16 与BTV-21型均为东方型，而中国与澳大利亚毒株BTV-15 型毒株的Seg-3 形成了1 个新的独立的远东型分支(图3a)，与东方型毒株的核酸序列相似度在80.4%～81.5%，氨基酸序列相似度在96.4%～97.5%。

中国BTV-15 型B105/YN/1996 毒株的Seg-4/VP4 与澳大利亚2012 年分离的BTV-15 型毒株具有最近的亲缘关系，核酸与氨基酸序列相似度为97.1%/98.2%，与中东和非洲BTV-15 毒株序列Seg-4 核酸序列相似度为79.3%～80.2%，VP4氨基酸序列相似度在93.0%～93.1%。Seg-4 构建的系统发生树的结果与Seg-3 的系统发生树类似(图3b)，BTV-15 型中国毒株与澳大利亚2012 年分离BTV-15 型毒株共同构成了远东型，与其他东方型毒株的核酸序列相似度在79.0%～83.6%，氨基酸序列相似度在93.0%～95.0%。值得注意的是，澳大利亚1982 年分离的BTV-15 型毒株的Seg-4 为东方型(图3b)，表明该毒株的Seg-4 基因节段很可能发生了基因重配。

2.6 中国BTV-15 型毒株的Seg-7 与Seg-10 系统发生树分析

虽然VP7 蛋白的氨基酸序列在BTV 之间高度保守，但Seg-7 序列在BTV 毒株间具有较高的变异度，可将其分为东方-1～3 以及西方-1～7等10 种地域型，显示Seg-7 的遗传多样性。中国BTV-15 型毒株B105/YN/1996 显示出与澳大利亚毒株最近的亲缘关系，核酸序列相似度分别为92.4% 与96.9%，而氨基酸序列相似度均为99.4%。中国与澳大利亚BTV-15 型毒株的Seg-7 在系统发生树上形成1 个独立的东方-1 型(图4a)，与属于西方-5 型的中东、非洲毒株的核酸序列相似度在81.4%～81.9%，氨基酸序列相似度在98.2%～98.3%。

在系统发生树上，中国、印度、日本与澳大利亚不同血清型BTV 毒株的Seg-10 聚为东方-1型；中国1996 年与1997 年分离的2 株BTV-15型毒株构成了独立的东方-2 型(图4b)，二者Seg-10/NS3 序列高度相似(99.9%/99.6%)，与东方-1 型毒株的Seg-10 核酸序列相似度在82.6%～87.3%，NS3 蛋白质氨基酸序列相似度在96.9%～98.6%。

图2 BTV-15 型毒株(B105/YN/1996) Seg-2 和Seg-6 系统发生树Fig.2 Phylogenetic tree for Seg-2 and Seg-6 gene segments of BTV-15 (B105/YN/1996)

图3 BTV-15 型毒株(B105/YN/1996) Seg-3 和Seg-4 系统发生树Fig.3 Phylogenetic tree for Seg-3 and Seg-4 gene segments of BTV-15 (B105/YN/1996)

图4 BTV-15 型毒株(B105/YN/1996) Seg-7 和Seg-10 系统发生树Fig.4 Phylogenetic tree for Seg-7 and Seg-10 gene segments of BTV-15 (B105/YN/1996)

3 讨论

1996—2017 年，本实验室在中国不同地区先后分离到共计12 种血清型BTV (BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21 和-24)，表明中国流行BTV 血清型的多样型与复杂性[22-26]。掌握中国BTV 流行血清型毒株的全基因组序列，不仅可掌握中国流行BTV 的血清型，也为BTV 诊断检测技术的开发、BTV 毒株遗传与演化特征等方面的研究提供数据。

基因重配是基因组分节段RNA 病毒进化的主要动力，可对病毒的感染特性和传播特性产生重要的影响[27]。自然界中，不同血清型或地域型的BTV 毒株共感染同一宿主动物的情况十分普遍，而BTV 毒株之间的基因重配可发生在任意1 个节段上，使得BTV 呈现出高度的遗传多样性[28]。通过对B105/YN/1996 毒株的全基因组测序发现：B105/YN/1996 毒株的Seg-1、-2、-3、-4 和-6 与澳大利亚2012 年分离的BTV-15 型毒株之间具有最近亲缘关系；该毒株的Seg-5 却与印度BTV-1 型IND1992/02 毒株高度相似，在系统发生树上与印度毒株聚为一簇，处于印度支系的内部；Seg-8 与Seg-9 则与中国同一时期流行的BTV-1 型Y863 毒株与BTV-4 型YTS-4 毒株显示了最近亲缘关系。分析其原因在于：一方面，B105/YN/1996 可能发生多次基因重配，使得病毒的基因节段在进化上出现了高度的多样型，不同基因节段有着不同的最近共有祖先(most recent common ancestor，MRCA)；另一方面，中国与澳大利亚和印度之间存在频繁的牛羊及其畜产品的贸易，由此推测在中国与澳大利亚和印度之间很可能也存在着BTV 的扩散，为BTV 在不同地域流行毒株之间发生基因重配创造了条件。

B105/YN/1996 与澳大利亚BTV-15 型毒株的Seg-3、Seg-4 与Seg-7 在系统发生树上分别构成了独立的2 个远东地域型和1 个独立的东方-1型；中国的BTV-15 型毒株的Seg-10 则在系统发生树上形成独立的东方-2 型。这些特殊地域型的发现进一步丰富了对BTV遗传多样性的认识，另一方面也显示中国与澳大利亚BTV-15 型毒株的这些基因节段在起源上的独特性。BTV-25～BTV-27等3 种BTV 新血清型毒株的基因节段在系统发生树上形成了独立于其他血清型BTV 之外的进化分枝[9-10]，研究也同时发现新血清型BTV 展示了与其他不同血清型不同的感染特性，如BTV-25型在山羊上的感染持续期可长达25 个月，甚至可能终生带毒[29]，BTV-26 在山羊上很容易发生接触性传播而无须媒介库蠓的介导[30]。这提示特殊的基因序列很可能赋予BTV 不同的感染特性，BTV-15 型毒株中形成独立地域型的基因节段起源是什么，在感染特性上与其他血清型BTV是否存在不同等科学问题仍值得进一步研究。

4 结论

本研究完成了中国分离BTV-15 型毒株B105/YN/1996 的全基因组测序，序列分析显示该毒株的不同基因节段在进化上具有高度多样性，不同的基因节段分别与澳大利亚、中国和印度毒株显示了最近的亲缘关系，提示该毒株为基因重配毒株；该毒株的Seg-3、-4、-7、-10 形成了在系统发生树上形成独立的进化分支，进一步表明其在进化上的特殊性。研究结果丰富了对BTV 遗传多样性的认识，为掌握中国BTV-15 型毒株的演化和诊断试剂的开发提供了科学依据。