微柱高效液相色谱法测定体液中降压药的含量

李金祥，李佳欢，唐晓妍

(辽宁师范大学化学化工学院，辽宁 大连 116000)

高血压是中老年人群中常见的慢性疾病，也是心脑血管疾病的主要危险因素。根据2012年世界卫生组织报告，全世界四分之一的成年人即大约11.3亿成年人患有高血压，并且中风和心脏病导致的死亡率为50%。因此，控制高血压对于降低心血管疾病并发症(如中风、心脏骤停、冠心病、充血性心力衰竭等)至关重要。为了减少心血管疾病、并发症并避免死亡，目标是使患者的血压低于 140/90 mmHg。

在高血压的临床治疗中，单一用药通常无法达到目标血压，而是需要两种或多种药物共同作用，将具有不同作用机制的降压药联合使用有助于达到目标血压，同时这与单一药物治疗相比具有多个优势[1]。不同机制的药物作用于人体，会使降压效果更好，并改善治疗的依从性。使用的剂量较低可以减少药物的副作用，并且降低治疗成本。

以往的文献中报道了许多检测体液中降压药含量的方法，如分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、亲水作用色谱法、毛细管电色谱法等，其中高效液相色谱法最为常用。Khuroo等[2]建立了一种液相色谱串联质谱检测器(LC-MS)的方法用来同时检测血浆中的阿替洛尔和氯噻酮的含量，该方法的灵敏度和特异性适合于阿替洛尔和氯噻酮的临床药代动力学研究。Tabrizi等[3]利用荧光光谱法测定药物制剂中的阿替洛尔和卡维地洛的含量。

但是并没有查到利用微柱液相色谱同时分离和检测氢氯噻嗪(HCT)、阿替洛尔(ATN)和利血平(RSP)三种降压药的方法。本研究建立了一种微柱液相色谱串联紫外检测器的方法用来同时分离和检测血浆和尿液两种基质中HCT、ATN和RSP三种降压药。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器与试剂详见表1、表2所示。

表1 实验仪器

表2 试剂与材料

1.2 色谱柱的制备

以 5 μm 裸硅球为载体，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)为交联剂，甲醇与环己醇的混合溶液作为致孔剂，偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，在内径为 150 μm 的石英毛细管内，以原位聚合的方式制备了硅胶颗粒担载有机聚合物(GMA-co-PETA)的整体基质。由于GMA本身带有环氧活性基团，使环氧活性基团进一步与亚硫酸钠溶液进行磺化反应，使担载基质表面带有磺酸根离子(SO32-)，即制得亲水性强阳离子交换整体柱，而整体柱的亲水性则表现在SO32-和含有亲水性基团-OH的交联剂的使用。

1.3 生物样品前处理

在分析生物样品的过程中，对血浆和尿液等生物样品的预处理非常重要，这可能直接影响分析的最终结果。目前生物样品预处理方法包括液-液萃取[4]、固相萃取和蛋白质沉淀法。本文采用对血浆和尿液进行液-液萃取法以获得较为纯净的基质。

1.4 血浆样品前处理

准确移取 1 mL 血浆，向其中加入一定量HCT、ATN和RSP的标准样品溶液，使得样品质量浓度为 12 μg/mL。在 8000 r/min 下离心 5 min。离心后将淡黄色上层物质转移至另一干净容器中，向其中加入 500 μL 乙酸乙酯，混合均匀后静置 15 min, 将上层溶液取出并蒸干，残余物质用乙腈溶解，过滤后备用。

1.5 尿液样品前处理

准确移取 200 μL 尿液，向其中加入一定量HCT、ATN和RSP的标准样品溶液，使得样品质量浓度为 12 μg/mL。再向其中加入 1 mL 乙腈，混合均匀后在 8000 r/min 下离心 10 min，将上层清液转移至另一干净容器中，过滤备用。

2 结果与讨论

2.1 分离条件的优化

利用亲水性强阳离子整体柱分离HCT、ATN和RSP三种降压药的原理为:当三种分析物在流动相的作用下进入色谱柱的过程中，三种分析物会发生不同程度的质子化，并与固定相上SO32-产生静电作用；根据三种分析物与固定相作用力和亲水作用的不同从而实现分离。

为了获得较好的分离效果，对流动相的组成、浓度、pH及有机添加剂的含量等实验条件进行了优化。最后获得的分离最佳条件为:以Na2HPO4作为流动相，浓度为 50 mmol/L，pH=9.1，5%乙腈作为有机添加剂，在分离的最佳条件下获得的色谱图如图1。

图1 HCT、ATN和RSP对照品分离色谱图

根据离子交换机理可以判断分析物的出峰顺序依次为HCT、ATN和RSP。因为在流动相pH=9.1的实验条件下，HCT不发生质子化，最先出峰，ATN和RSP发生质子化，而RSP质子化的程度更大即所带正电荷更多，所以与固定相上负电荷之间的静电作用更强，最后出峰。该出峰顺序与单一对照品进样获得的出峰顺序一致。

2.2 血浆基质中的分离

在最佳的分离条件下，将HCT、ATN和RSP三种降压药在血浆基质中进行分离，获得的色谱图如图2。

图2 血浆基质中HCT、ATN和RSP分离色谱图

对比图1和图2看出，血浆基质对三种降压药的分离并不存在干扰。

2.3 尿液基质中的分离

在最佳的分离条件下，将HCT、ATN和RSP三种降压药在尿液基质中进行分离，获得的色谱图3。

图3 尿液基质中HCT、ATN和RSP分离色谱图

对比图1和图3看出，尿液基质对三种降压药的分离并不存在干扰。

3 结论