有机肥料粪大肠菌群指标检测时效性初探

王 洹,姚 莎,何 蓉,陈 萌

(云南省化工研究院有限公司，云南 昆明 650228)

粪大肠菌群是反映堆肥在发酵过程中是否完全腐熟的指标之一。目前在有机肥、有机-无机复混肥、生物有机肥、复合微生物肥料、农用微生物菌剂等肥料检测中，都会涉及到粪大肠菌群这个指标。粪大肠菌群(Fecd Coliform)是总大肠菌群的一部分，主要来自粪便[1]，是一群在44.5±0.5 ℃ 的条件下能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

中华人民共和国国家标准GB/T 19524.1-2004《肥料中粪大肠菌群的测定》[2]中明确规定肥料中的粪大肠菌群最大可能数(MPN)要小于等于100。粪大肠菌群数的高低是衡量肥料腐熟程度的重要体现指标，是堆肥能否有效杀死和消除肥料中所含的病原菌、寄生虫卵等有害物质[3]的依据。研究表明，施入农田肥料带入的粪大肠菌群，在土壤中可能会长期存活，并能进入作物体内，最终影响人体健康(尤其是老人和孩童)及农业环境，严重污染可能会引起流行疾病的发生[4]。

本实验室在日常委检样品检测-复检的过程中发现，肥料中的粪大肠菌群数会随着样品储存时间的加长出现下降的态势。这与叶小梅[5]在畜禽粪便自然堆放及施入农田后粪大肠菌群数量的消长研究结果相符(自然堆放的条件下，冬季和夏季粪便中粪大肠菌群数量在放置期间呈下降趋势)。中华人民共和国农业行业标准NY 525-2012《有机肥料》标准[6]中提到“经四分法缩分后的样品保存至少2个月，以备查用”，但在实际检验中发现，保存1个月以后的样品检验结果有时会与第一次检验的结果存在差异。为探究保存时间和保存条件对粪大肠菌群数指标检测结果的影响，进一步确定肥料样品最佳检测时间，特设计如下试验方案，以期在肥料样品检测时效性方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

实验中所涉及的10份样品，随机取自日常委检粪大肠菌群数指标不合格的样品。在无菌条件下将其分成两等份，1份常温保存，1份 4 ℃ 保存，每间隔一个月进行一次粪大肠菌群检测。

1.2 试剂

乳糖胆盐发酵培养基(生产批号：1075661)、伊红美蓝琼脂培养基(生产批号：1065911)和革兰氏染色液(生产批号：6105079)、乳糖发酵培养基(生产批号：1070521)，均购买自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 仪器设备

电子天平、试管、三角瓶、压力蒸汽灭菌器、电热鼓风干燥箱、恒温振荡器、洁净工作台、灭菌枪头、隔水式培养箱、显微镜、灭菌培养皿。

1.4 检测流程

采用多管发酵法，按照国家标准GB/T19524.1-2004《肥料中粪大肠菌群的测定》进行试验，通过乳糖胆盐发酵试验、平板分离、乳糖发酵试验观察产酸产气情况，按阳性发酵管数查MPN表，确定每克(毫升)肥料样品中的的粪大肠菌群数。

2 结果及分析

2.1 初始检测结果统计

表1中统计了随机抽取的10份粪大肠菌群数指标不合格样品粪大肠菌群数检测结果。

由表1可知，10份随机选出的肥料样品，初始检测结果显示，粪大肠菌群数均>1100，远超于标准中的规定限值(≤100)。这表明在肥料发酵腐熟过程中，粪大肠菌群没有被杀死，这样的肥料被农户施用到农田中，其中的粪大肠菌群就会感染到农作物上，影响农产品，尤其是蔬菜的卫生质量，进而影响人体健康。

表1 肥料鲜样检测结果统计

2.2 储存时间对检测结果的影响

将10份样品保存于常温、4 ℃ 条件下1个月和2个月后，检测粪大肠菌群指标结果如表2。

由表2 可知，随着肥料样品储存时间的增加，除样品1和样品7中的粪大肠菌群数未发生变化外，其余样品均有明显下降趋势，其中的5份样品在储存2个月之后检测结果发生显著变化，产品质量判定由不合格变成合格。初步推测粪大肠菌群数下降趋势不一，可能与肥料的组成成分有关。有的基质营养丰富，能较长时间为其中的粪大肠菌群提供生命物质，所以试验结果没有发生明显变化；有的肥料样品则变化巨大(不合格转变成合格)，可能是因为该样品中的菌群所需营养物质相对较少，或者是样品的理化性质发生改变，以及有机肥料自身继续腐熟等情况，无法长期为粪大肠菌群提供生命物质，导致菌群无法长期生存。

表2 不同保存条件下粪大肠菌群数对比

从表2中还可知，保存条件(常温或 4 ℃)对样品中的粪大肠菌群变化的影响明显不同，绝大多数常温储存的样品中粪大肠菌下降迅速，而低温冷藏的样品则能够减缓粪大肠菌下降的速度，但不能完全抑制。原因可能是在常温条件下菌群较为活跃，消耗营养物质速度较快，保存时间较长，营养跟不上，导致菌群数下降迅速。而低温保存的样品菌群活跃度低，对营养物质的消耗相对较慢，因此菌群数下降速度减缓。但常温保存和低温保存都无法完全抑制菌群的生命活动，营养物质持续减少，因此两种保存条件下都无法完全抑制菌群数下降的趋势。

从本次实验结果可知，相较而言，肥料样品在粪大肠菌群检测期间最好能够低温冷藏储存。同时，肥料样品中的粪大肠菌群检测具有时效性，在实际检测中合理安排试验时间，新鲜的肥料来样最好在极短的时间内完成检测，避免样品自身属性发生改变，致使结果发生偏差，不能反映有机肥料样品的真实情况，无法给企业生产者提供有价值的参考。

2.3 两种储存条件下粪大肠菌群数量变化

由图1和图2可知，不论是常温还是 4 ℃ 储存，10份随机选出的肥料样品，随着时间推移，80%的试样中粪大肠菌群数量发生不同程度的下降，总体呈现出下降趋势。间隔1个月复检，4 ℃ 储存的样品中粪大肠菌群变化幅度明显小于常温储存的，再次表明肥料样品可短时间低温冷藏待检。间隔2个月以后再对样品进行复检，发现两种方式储存的样品中粪大肠菌群数变化非常大，不能重现初检和第一次复检的结果。

图1 常温条件下粪大肠菌群的变化

图2 4 ℃条件下粪大肠菌群的变化

3 小结

研究发现，肥料中的粪大肠菌群数量随着时间推移，大部分样品呈现下降的趋势。为了能够客观的评价肥料品质，从生产企业送样，到检测机构制样、检测，整个过程能快则快(建议一周之内完成)。检验机构可通过空白样品及插入质控样品保证初检结果的准确性。若检测机构遇到间隔时间较长、需要复检的有机肥料样品时需特别注意。

研究还发现，跨时间段对肥料样品中粪大肠菌群数进行复检，检测结果不能复现，出具的复检报告可能并不能真实反应当时有机肥料样品的实际情况，提出复检的生产企业应严肃考虑产品的时效性，以避免对农民造成损失。