烤烟主栽品种K326和Y87成熟期中部叶含氮化合物的差异

张程涵， 赵会纳， 余 婧， 余世洲， 许本波， 雷 波*

(1.长江大学 生命科学学院， 湖北 荆州 434025； 2.贵州省烟草科学研究院 烟草行业分子遗传重点实验室， 贵州 贵阳 550081)

烟草是我国重要的经济作物之一，烟叶各种化学成分的含量及其比例影响烟气质量[1-2]。烟株从土壤或肥料中吸收的硝态氮和铵态氮优先供应烟株的顶叶，再缓慢向下运输[3]。生物碱、蛋白质、氨基酸等是烟叶中的主要含氮化合物[4-5]，对烟株的生长发育有重要的生理功能，如氨基酸参与构成酶、激素，调控能量代谢和物质转化[4]，可以平衡氮含量[6]，脯氨酸是一种渗透调节物质，提高烟株的抗逆性[7-8]。此外，含氮化合物是衡量烟叶品质的最重要指标[9]，烟碱影响烟气的劲头和浓度，决定烟气的生理强度[4]；蛋白质会产生类似羽毛燃烧的臭味[10]；氨基酸可以与还原糖在烟叶烘烤、醇化等过程发生美拉德反应，生成多种香气物质[11]。因此，烟叶中含氮化合物差异对烟株生长和品质评价有重要意义。在成熟期烟株光合能力减弱、分解能力增强，化学成分趋于协调，是烟株生长发育过程中重要时期，而含氮物质含量受遗传、栽培措施、气候等多种因素的影响[12-16]，其中品种是彰显品质特色的关键因子[17]。近年来，不少学者采用偏最小二乘法结合均值差异分析判别筛选烟草中差异代谢标记物[18-21]。K326和Y87是我国目前各烟区的主要种植品种，其烟叶质量对我国卷烟工业的效益有一定影响。因此，掌握K326和Y87成熟期烟叶的含氮物质差异，为其精准合理利用与种植调控含氮物质含量提供依据。

1材料与方法

1.1种植地概况

烤烟品种K326和Y87种植于贵州省贵阳市清镇市卢狄村。施基肥前种植地土壤全氮0.172%、水解氮131.89 mg/kg、全磷0.81 g/kg、有效磷12.48 mg/kg、全钾27.58 g/kg、速效钾241.00 mg/kg、有机质34.15 g/kg、pH为4.63，土壤养分含量均在合理范围，适合种植烤烟。

1.2种植方法

烤烟品种K326和Y87各种植3个小区，各小区种植6行、每行20株、共120株。移栽行距110 cm，株距50 cm。施N量为90 kg/hm2，分2次施入。其中：基施量为63 kg/hm2，用贵州科泰金福肥业有限公司生产的N∶P∶K=12∶12∶24的专用肥，在起垄时条施；追施量为27 kg/hm2，用贵州科泰金福肥业有限公司生产的N∶P∶K=15∶0∶30的专用肥，在移栽后35 d窝施。打顶留叶数为16片/株。其他田间管理措施按当地优质烟栽培技术。

1.3烟叶样品采集

选择田间发育良好的烟株，单株挂牌，在成熟期采集每个小区的第8叶位烟叶样品，去主脉后装进冻存管立即放入液氮带回实验室，将样品进行真空冷冻粉碎后测定其含氮化合物含量。

1.4测定项目

总糖、还原糖、总氮、蛋白质含量参照文献[22-24]测定的方法，可溶性蛋白质用南京建成生物工程研究所生产的总蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)测定，生物碱参照文献[25]测定，氨基酸、多胺和铵离子参照文献[26]的方法测定。

1.5数据处理

采用数据分析软件SIMCA13.0对K326和Y87烟叶含氮化合物数据进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，采用统计软件SPSS 16.0的独立样本t检验对2个品种进行含氮化合物均值比较，并将分析结果在Excel进行整理。

偏最小二乘法分析(PLS-DA)中，VIP值是衡量变量对分类贡献大小的重要指标，VIP值越大对分类贡献越大，一般筛选VIP>1.0且均值比较中存在0.05水平或0.01水平差异的代谢物质作为差异代谢物质，试验采用此方法进行差异含氮物质筛选。

2结果与分析

2.1K326和Y87成熟期中部叶含氮化合物种类

由表1可见，主栽品种K326和Y87烟叶共36种含氮化合物，主要包括生物碱(烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱)、总氮、蛋白质、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺等)、多胺(酪胺、腐胺、苯乙胺等)及铵离子。

表1K326和Y87成熟期中部叶测定的含氮物质

2.2K326和Y87成熟期中部叶的含氮物质差异

由图1可见，K326和Y87烟叶含氮物质差异明显，分类明显。在主成分散点图上可以明显的分为2类，一类为K326，另一类为Y87，可筛选K326和Y87烟叶的差异含氮物质。

由图2可见，对K326和Y87烟叶分类贡献较大(VIP>1.0)的代谢产物有瓜基丁胺、天冬氨酸、高精米、谷氨酸、酪胺、异亮氨酸、精氨酸、蛋白质、亚精胺、天门冬酰胺、苏氨酸、γ-氨基丁酸、总氮、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸。

图1K326和Y87烟叶含氮化合物的主成分散点分布

图2K326和Y87烟叶含氮化合物的载荷图分布

2.3K326和Y87成熟期中部叶含氮物质差异的t检验

由表2可知，总氮、蛋白质、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸在K326和Y87烟叶间差异不显著，因此在差异物质筛选中剔除。综合偏最小二乘法判别分析(VIP>1.0)和t检验共筛选了K326和Y87烟叶的差异含氮物质有13种，分别为γ-氨基丁酸、高精米、胍基丁胺、精氨酸、酪氨酸、酪胺、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺、缬氨酸、亚精胺、异亮氨酸。

表2K326和Y87烟叶中含氮化合物及其t检验

K326烟叶的1种含氮物质(瓜基丁胺)含量极显著低于Y87，3种含氮物质(高精米、酪胺、异亮氨酸)含量极显著的高于Y87，9种含氮物质(γ-氨基丁酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺、缬氨酸、亚精胺)含量显著高于Y87。

3小结

试验发现，K326和Y87成熟期中部烟叶的差异含氮物质主要是氨基酸，共筛选出13种差异氨基酸，其中K326烟叶的1种含氮物质(瓜基丁胺)含量极显著低于Y87，3种含氮物质(高精米、酪胺、异亮氨酸)含量极显著的高于Y87，9种含氮物质(γ-氨基丁酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺、缬氨酸、亚精胺)含量显著高于Y87，但K326和Y87烟叶的总氮、蛋白质、生物碱含量差异均不显著。可能是与2个品种本身的遗传特性、自身氮素代谢及氨基酸的合成和代谢有关。因试验为一年单点试验，可能还存在一定的局限性，在下一步的研究中拟结合转录组数据进一步分析，探讨K326和Y87烟叶的氨基酸代谢差异及差异原因。