Tortoside A对人宫颈癌SiHa细胞凋亡及细胞周期影响的初步研究

马晓玲，刘雪松，柴丽华，陈刚，李宁，魏鸿雁

·论著·

Tortoside A对人宫颈癌SiHa细胞凋亡及细胞周期影响的初步研究

马晓玲，刘雪松，柴丽华，陈刚，李宁，魏鸿雁

830002 乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区中药民族药研究所（马晓玲、刘雪松、柴丽华、陈刚、魏鸿雁）；830046 乌鲁木齐，新疆大学生命科学与技术学院（刘雪松、柴丽华）；110016 沈阳，沈阳药科大学中药学院（李宁）

考察 Tortoside A（TOA）对人宫颈癌 SiHa 细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。以 CCK-8 法、流式细胞术等检测 TOA 对人宫颈癌细胞增殖抑制作用、对细胞凋亡水平和细胞周期的影响，Western blot 法检测 TOA 对 SiHa 细胞凋亡相关蛋白表达的影响。TOA 通过作用于Caspase、Bcl-2 家族蛋白而诱导细胞发生了凋亡，并使细胞停滞于 G1 期，降低肿瘤细胞的增殖活性。TOA 对 SiHa 细胞的增殖具有抑制作用，其抑制作用可能与促进细胞凋亡有关。

TOA； SiHa 细胞； 增殖； 凋亡

骆驼刺 Alhagi sparsifolia shap. 为豆科骆驼刺属植物，是新疆干旱沙漠地区特有的一种植物，落叶灌木，耐旱、耐高温、抗风沙是它的特性[1-3]。课题组前期已对骆驼刺进行了初步研究[4-8]，证实骆驼刺提取物具有抗肿瘤和调节免疫等药理活性[9-10]，对小鼠实体瘤模型具有一定的敏感性，抑瘤率达到 24.8%。经过系统分离有效部分中的化学成分，发现其中 Tortoside A（TOA）的含量较高[11-12]，有理由推测 TOA 可能是骆驼刺的主要有效成分之一。为了深入探讨骆驼刺中分离得到的 TOA 对肿瘤细胞的影响，本研究通过体外培养人宫颈癌 SiHa 细胞，采用体外细胞培养技术、流式细胞术及多种分子生物学技术观察 TOA 对宫颈癌 SiHa 细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其发生机制，为未来开发利用骆驼刺资源提供实验依据，同时对寻找新的抗癌药物，充分挖掘利用新疆维吾尔药资源是一项非常有意义的工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 TOA（结构如图1 所示）由沈阳药科大学李宁教授提供，经 HPLC 面积归一法纯度约为 98.1%，用 DMSO 溶解，–20 ℃保存备用。

图1 TOA 结构

Figure 1 The structure of TOA

1.1.2 细胞 SiHa 人宫颈癌细胞株来源于凯基生物。

1.1.3 试剂 胎牛血清（FBS）为依科赛生物产品；DMEM（高糖）培养基（C11965500BT）为美国 Gibco 公司产品；Cell Counting Kit-8 细胞增殖/毒性检测试剂盒（FC101-03）、TransZol Up（ET111）、Easy II Protein Quantitative Kit (BCA)（DQ111-01）均为全式金生物产品；Giemsa 染液（D010）为南京建成公司产品；顺铂（P4394-25MG）为美国 Sigma 公司产品；5X All-In-One RT MasterMix（G492）为 Abm 公司产品；QuantiNava SYBRGreen Kit（208054）为凯捷公司产品；RIPA 裂解液（AR0105）为博士德公司产品。

1.1.4 仪器 CO2细胞培养箱和生物安全柜均购自上海力康仪器有限公司；Eclipse TS100-F 荧光倒置显微镜购自日本尼康公司；xMarkTM酶标仪、蛋白转膜仪、PCR 仪均购自美国 Bio-Rad 公司；LSR II 流式细胞仪购自 BD 公司；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；实时荧光 PCR 仪购自美国 ABI 公司；Chemiscope 3000 化学发光成像仪系统购自上海勤翔科学仪器有限公司；DYCZ-24DN 电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于 37 ℃水浴中，快速晃动冻存管，2 min 内使细胞快速解冻，将解冻后的细胞快速加入提前加有 9 ml 完全培养基的 15 ml 离心管中，离心弃上清，将细胞接种到培养瓶中，37 ℃、饱和湿度、5% CO2细胞培养箱中培养，每隔 2 ~ 3 天传代一次。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞存活率 取生长状态良好，汇合率达 90% 的 SiHa 细胞，完全培养基制备成 5 × 104个/ml 单细胞悬液，接种至 96 孔板中（100 μl/孔），37 ℃、5% CO2培养 24 h 贴壁后，弃去培养基，加入 100 μl TOA（2.5、5、10、20、40、80 μg/ml）药物，同时设置空白对照组（加入与实验组相当的 DMSO 溶剂），每组 5 个重复，放入培养箱37 ℃、5% CO2培养。分别干预 48 h 后，每孔加入培养基总体积 10% 的 CCK-8，继续在培养箱中孵育，1 h 后用酶标仪测定 450 nm 处的值，根据细胞存活率计算 IC50值。为捕捉细胞的凋亡信号，避免非凋亡性杀伤细胞过多，故在接下来的试验中将药物干预的高、低剂量分别设置为1/2 IC50值和 1/4 IC50值。

1.2.3 细胞克隆形成能力的影响 参考 Lin 等[13]的实验方法，收集生长状态良好汇合率达90% 的 SiHa 细胞，用完全培养基制成密度为 100 个/ml 的单细胞悬液，按 200 个/孔接种到 6 孔板中，常规培养 24 h 贴壁后，以不同浓度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和顺铂干预 24 h，每组设 3 个复孔。15 d 后，弃去培养基，PBS 洗 2 次，4% 的甲醛室温固定 20 min，PBS 洗 2 次，每孔加入 500 μl 的 Giemsa 染液 A 液，室温染色 1 min，不弃去 A 液，加入 1 ml Giemsa 染液 B 液，继续染色 5 min，弃去染色液，PBS 洗 3 次，晾干后拍照计数。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长状态良好汇合率达 90% 的 SiHa 细胞，胰酶消化，用完全培养基制成密度为 5 × 104个/ml 的单细胞悬液，接种到 6 孔板中（2 ml/孔），37 ℃、5% CO2培养 24 h 贴壁后，弃去培养基，以不同浓度 TOA 和顺铂进行干预，每组 3 个复孔。干预 48 h 后将培养液吸出至离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞），PBS 洗涤贴壁细胞两次，将 PBS 一并收集至离心管内，胰酶消化细胞，将细胞转移到离心管内，1000 r/min 离心 5 min，弃上清。用预冷的 PBS 洗涤 2 遍，弃干净上清。加入 400 μl AnnexinV 结合液重悬细胞，过 200 目筛网，制成单细胞悬液。加入 5 μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，4 ℃避光孵育 15 min。再加入 10 μl PI 染色液，轻轻混匀，4 ℃避光放置 5 min。在 30 min 内进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 取生长状态良好汇合率达 90% 的 SiHa 细胞，胰酶消化，用完全培养基制成密度为 5 × 104个/ml 的单细胞悬液，接种到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培养 24 h 贴壁后，弃去培养基，以不同浓度 TOA 和顺铂进行干预 48 h，每组 3 个复孔。胰酶消化干预后的细胞，用 5 ml 的 PBS 洗一遍，用 500 μl 预冷 PBS 重悬细胞，将细胞悬液加入到 3.5 ml 预冷的 80% 乙醇中，4 ℃固定过夜。2500 r/min 离心 5 min，沉淀细胞。小心吸除上清，以避免吸走细胞。用预冷的 PBS 洗涤 2 遍，弃干净上清。加入 500 μl PI/RNase Staining Buffer 重悬细胞，过 200 目尼龙筛网，制成单细胞悬液。4 ℃避光孵育 30 min。用流式细胞仪在激发波长 488 nm 处检测红色荧光，同时检测光散射情况。分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射分析。

1.2.6 JC-1 测定线粒体膜电位 将 SiHa 细胞，完全培养基制备成 5 × 104个/ml 单细胞悬液，以 2 ml/孔接种到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培养24 h 后弃去培养基，以不同浓度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和顺铂干预 48 h，每组 3 个复孔。胰酶消化各组细胞，离心弃上清，用 1 ml PBS 重悬细胞于 1.5 ml 离心管中，离心吸掉上清。用0.5 ml JC-1 工作液重悬细胞，于 37 ℃，5% CO2培养箱孵育 15 min。400 ×离心 5 min，弃去上清，用 1 ml PBS 洗涤细胞 2 次，之后离心，吸掉上清，用 0.5 ml PBS 重悬细胞，过 200 目筛网，30 min 内进行流式细胞仪检测分析。

1.2.7 Hoechst 染色检测细胞凋亡情况 将 SiHa 细胞，完全培养基制备成 5 × 104个/ml 单细胞悬液，接种到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培养 24 h 贴壁后，弃去培养基，以不同浓度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和顺铂进行干预，每组 3 个复孔。干预 48 h 后，弃去培养基，PBS 洗 2 次，4% 的多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 2 次，每孔加入 500 μl 的 Hoechst 染色液，室温染色 5 min，弃去染色液，PBS 洗 2 次，在显微镜下激发波长350 nm，发射波长参数为 460 nm 时，观察细胞凋亡情况。

1.2.8 Western blot 检测凋亡蛋白的表达 参考朱晗清和高丰厚[14]的试验方法，用不同浓度的 TOA 处理 SiHa 细胞 24 h，使用 RIPA 裂解液和 PMSF（RIPA:PMSF = 100:1）从 SiHa 细胞中提取总蛋白。用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。通过 10% SDS-聚丙烯酰胺电泳分离蛋白质，并转到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉在室温下封闭 1 h。然后在 4 ℃条件下进行一抗孵育过夜，TBST 清洗 3 次，膜与兔抗/鼠抗在室温调节下孵育 1 h，再用 TBST 清洗 3 次，最后用ChemiScope mini 化学发光仪检测、拍照，并对各蛋白条带的灰度值进行分析，将β-actin 作为内参，用目的条带与β-actin 条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 TOA 对 SiHa 细胞增殖抑制率的影响

由表1 可知，TOA 高浓度组存活率低于低浓度组，呈明显的剂量依赖关系，差异具有统计学意义（< 0.05）。化合物 TOA 对 SiHa 细胞的生长抑制作用呈浓度和时间依赖性。

2.2 克隆形成实验结果

细胞克隆实验可定量分析单个细胞的增殖潜力，清楚细胞的增殖和独立生存能力[14]。分别用不同浓度药物处理 SiHa 细胞后，检测细胞的克隆形成能力[15]。从图2中，我们可以明显观察出药物干预的细胞同空白组相比，细胞克隆形成的明显较少。其定量分析结果见表2 所示：同空白组比较，化合物 TOA 干预细胞后，形成的克隆数量明显减少（< 0.05）。

表1 TOA 对细胞增殖抑制率及 IC50值的影响（，n = 5）

注：*与空白对照组比较，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

图2 TOA 对 SiHa 细胞克隆形成作用

Figure 2 Effect on SiHa cells clone formation of TOA

表2 不同浓度 TOA 对 SiHa 细胞克隆形成的作用（，n = 3）

注：*与空白组比较，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

图3 TOA 作用于 SiHa 细胞 Hoechst 染色图片

Figure 3 Effect of TOA on colony formation in SiHa cells

图4 SiHa 细胞线粒体膜电位检测流式图

Figure 4 Effect of TOA on depolarization of mitochondrial membrane potential in SiHa cells

2.3 Hoechst 染色实验结果

诱导肿瘤细胞凋亡是评价抗肿瘤药物疗效的主要指标之一，本试验通过 Hoechst 染色，在显微镜下观察经 TOA 处理后的 SiHa 细胞凋亡发生的程度。实验结果如图3所示，荧光显微镜下观察，TOA 高剂量组出现致密浓染的颗粒状荧光，可见细胞荧光明显增强，部分出现高染，细胞核固缩、碎裂增多以及部分可见细胞核中染色体汇集于两端，呈典型的凋亡特征，由此可见 TOA 能显著促进 SiHa 细胞凋亡。

2.4 线粒体膜电位检测结果

肿瘤细胞线粒体膜电位的降低是肿瘤细胞早期凋亡的特征之一，故本试验采用 JC-1 染色，以流式细胞仪检测经 TOA 处理后的 SiHa 细胞的线粒体膜电位[16]。在图4的象限中可观察到膜电位降低的变化。其定量分析结果如表3 所示，与空白组比较，TOA 高、低剂量组处理 SiHa 细胞 48 h 后，其线粒体膜电位下降比率分别达到（14.500 ± 0.755）% 和（12.847 ± 0.404）%，有显著差异（< 0.01）。

表3 流式检测 TOA 对 SiHa 细胞线粒体膜电位的作用（，n = 3）

注：*与空白组比较，< 0.01。

Note:*Compared with control group,< 0.01.

图5 TOA 作用于 SiHa 细胞凋亡检测流式图

Figure 5 Effect on apoptosis of SiHa cells by flow cytometry

2.5 细胞凋亡检测结果

Annexin V-FITC/PI 染色后，可标示处于正常细胞群、早期凋亡细胞、晚期凋亡和坏死细胞等不同细胞群[16]。如图5 所示，TOA 作用 48 h后，可显著诱导 SiHa 细胞发生凋亡，而随着 TOA浓度增加，细胞凋亡率也有所增加，统计结果见表4。

2.6 细胞周期检测结果

实验结果如图6、图7所示，作用 48 h 后，TOA 可使 SiHa 细胞 G0/G1 期细胞所占的百分比增加，提示 TOA 可使细胞均阻滞于 G1 期，所以我们认为 TOA 对于细胞的阻滞是发生在G1 期的。

表4 流式检测 TOA 对 SiHa 细胞凋亡的作用（，n = 3）

注：*与空白组比较，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

图6 SiHa 细胞周期检测流式图

Figure 6 The flow chart of SiHa cells cycle detected by TOA intervention

图7 TOA 干预 SiHa 细胞周期作图

Figure 7 Effect on apoptosis of SiHa cells

图8 Western blot 实验条带图及柱状图

Figure 8 The chart of Western blot experiment

2.7 Western blot 实验结果

如图8 所示，TOA 作用于 SiHa 细胞 24 h 后，与对照组相比，Caspase-3 和Caspase-7 表达增加，同时Caspase-3 的底物 PARP 蛋白被剪切活化，亦显著降低 Bcl-2 的表达。说明 TOA 诱导宫颈癌细胞的凋亡可能与 Caspase 家族有关。

3 讨论

骆驼刺 Alhagi sparsifolia shap. 为豆科骆驼刺属植物，在本研究中，我们首先考察了 TOA 对人宫颈癌细胞 SiHa 的增殖抑制作用。结果显示，TOA 对细胞的增殖抑制作用较强。继而通过流式细胞术检测细胞凋亡率可以得出这样的结论：TOA 能够诱导 SiHa 细胞发生凋亡。

当细胞发生凋亡时，死亡信号通过细胞表面的信号分子传递到Caspase-7 并将其激活，继而引起Caspase-3 的激活，诱导凋亡[17-18]。Western blot 的结果显示，TOA 作用后能使Caspase-3 和 Caspase-7 的表达上调，使细胞中 Bcl-2 表达下调，同时剪切Caspase-3 的底物 PARP。推测 TOA 诱导宫颈癌细胞的凋亡可能与 Caspase、Bcl 家族有关。细胞增殖和凋亡水平的改变常与细胞周期调控的变化有关。细胞周期沿着 G1、S、G2、M 期的顺序运转[19]。G1 期是启动细胞周期循环的关键，其运转状态是多种疾病的发病基础，也是药物发挥治疗作用的切入点[20]。本实验显示，TOA 可以使宫颈癌细胞停滞于 G1 期，阻止其向 S 期及 M 期转化，从而使肿瘤细胞生长缓慢并降低其增殖活性。因此，TOA 诱导宫颈癌细胞发生了凋亡，并使细胞停滞于 G1 期，降低肿瘤细胞的增殖活性。TOA 可以作为一个潜在抗宫颈癌药物先导化合物，对其作用机制做进一步的研究。

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Tortoside A induces apoptosis of human cervical cancer cells and affects cell cycle in the initial research

MA Xiao-ling, LIU Xue-song, CHAI Li-hua, CHEN Gang, LI Ning, WEI Hong-yan

Author Affiliations:Xinjiang Institute of Chinese Medicine and Medicine of National, Urumqi 830002, China (MA Xiao-ling, LIU Xue-song, CHAI Li-hua, CHEN Gang, WEI Hong-yan); College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China (LIU Xue-song, CHAI Li-hua); School of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Pharmaceutical University, Shen Yang 110016, China (LI Ning)

The possible mechanism on the proliferation and apoptosis of human cervical cancer cells effected by TOA was investigated.The CCK-8 method was used to detect the inhibitory effect of TOA on the proliferation of human cervical cancer cells, the apoptosis level and cell cycle of cervical cancer cells detected by flow cytometry, the related protein expression apoptosis of cervical cancer cells were detected by Western blot.TOA induced apoptosis of cervical cancer cells by acting on Caspase and Bcl-2 family proteins, and arrested the cells in the G1 phase, reducing the proliferation activity of tumor cells.TOA has an inhibitory effect on the proliferation of cervical cancer cells, and its inhibitory effect may be related to the promotion of cell apoptosis.

TOA; SiHa cell; proliferation; apoptosis

WEI Hong-yan, Email: whywlmq@sina.com

新疆维吾尔自治区自然科学基金（2018D01B12）

魏鸿雁，Email：whywlmq@sina.com

2020-11-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.007