重组人促红细胞生成素对新生鼠脑室周围白质软化的影响及其机制

宋茂，曹云涛，雷贤明

遵义医科大学附属医院，贵州遵义 563000

脑室周围白质软化（PVL）是早产儿脑白质非出血性神经病理学损伤的主要类型，其主要病理为脑缺氧、缺血、炎症等多种因素引起脑组织少突胶质细胞（OLs）丢失、小胶质细胞活化、神经元死亡，导致脑白质坏死性病变、髓鞘减少及脑室扩大［1-2］。PVL发生率随着胎龄降低而增加，在胎龄为24～32周、出生体质量＜1 500 g的早产儿中发病率19.8%～34.1%；其不仅是脑瘫的主要危险因素，还与儿童社交和情感发展障碍、注意力障碍、认知缺陷及视听觉障碍等有关［2-3］。目前，尚未发现对PVL有效的治疗措施。因此，寻找治疗早产儿PVL和改善PVL所致神经功能障碍的潜在方法有重要临床意义。研究发现，促红细胞生成素（EPO）是重要的神经保护和营养因子，外源性EPO可减轻新生儿脑损伤［4-5］。2"，3"-环核苷酸3"-磷酸二酯酶（CNPase）为OLs和髓鞘标志物，其表达减少可提示OLs成熟及髓鞘再生障碍［6］。神经胶质抗原2（NG2）是少突胶质细胞前体（pre-OLs）特异性细胞标志物。当发生脑损伤时，pre-OLs可代偿性增殖分化从而促进OLs成熟和髓鞘形成，使NG2表达增多［7］。2019年2月—2020年1月，本研究采用外源性重组人促红细胞生成素（rEPO）干预新生鼠PVL模型，通过观察新生鼠脑组织形态及脑组织中CNPase和NG2的表达，探讨rEPO对新生鼠PVL神经保护的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：亲代SD大鼠20只，其中雄性大鼠5只，体质量320～380 g；雌性大鼠15只，体质量200～250 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2014-0011。主要试剂：rEPO（依普定）4 000 IU/mL购自山东科兴生物制品有限公司（国药准字S20030083）；卢卡斯固蓝（LFB）髓鞘染色液（G3245）购自北京索莱宝科技有限公司；CNPase一抗购自R&D System（ab227218）；NG2一抗购自北京博奥森生物技术有限公司（bs-5829R）；鼠兔通用型二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 分组处理与PVL模型制作 将15只雌鼠及5只雄鼠随机以3∶1的比例进行合笼自行交配；待雌鼠产鼠后，选择72只产后第3天SD大鼠，将其随机分为PVL模型组、rEPO干预组和假手术组各24只，各组体质量、雌雄比例具有可比性。PVL模型组、rEPO干预组根据前期课题组PVL建模方法［8］，将新生鼠结扎左颈总动脉，随后给予低氧混合气体（8%O2+92%N2）缺氧70 min，建立PVL模型；假手术组只分离左颈总动脉，但不行结扎和缺氧处理。

1.3 干预处理与标本获取 于术后1 d，将rEPO干预组新生鼠经腹腔注射5 IU/g稀释浓度为200IU/mL的rEPO［2］，1次/天，连续注射7 d；PVL模型组及假手术组新生鼠以相同方式注射相同容积的生理盐水。于术后3、7、14 d分别从各组中随机抽取8只新生鼠，采用多聚甲醛灌注心脏处死，取新生鼠脑组织常规脱水石蜡包埋。

1.4 脑组织形态观察 各组随机选取部分石蜡包埋的脑组织切片，再行脑冠状面切片，切片厚度5μm。行HE染色于光镜下观察各组侧脑室及脑室周围白质组织形态，行LFB髓鞘染色于光镜下观察各组髓鞘组织形态。

1.5 脑室周围白质组织CNPase、NG2表达检测 采用免疫组织化学法。选取切片厚度3～4μm的脑组织，常规脱水、脱蜡；抗原修复，封闭抗原；滴加一抗（CNPase滴度1∶200、NG2滴度1∶100）过夜，复温后滴加二抗孵育30 min；DAB镜下显色30 s后苏木素复染，切片分化后再次脱水、透明，中性树脂封片。选用Image-Pro Plus 6.0对封片图像进行定量分析，计算平均光密度（AOD）值以此表示CNPase、NG2表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组新生鼠脑组织形态观察结果

2.1.1 侧脑室HE染色结果 在术后各时间点，PVL模型组及rEPO干预组均可见左侧侧脑室较对侧扩大，假手术组双侧侧脑室均未见明显病理改变；PVL模型组术后14 d脑组织出现脑萎缩，左侧脑室明显扩大；rEPO干预组术后14 d可见脑萎缩、左侧脑室扩大，但与PVL模型组比较病理改变均较小。见OSID码图1。

2.1.2 脑室周围白质HE染色结果 术后3 d，PVL模型组及rEPO干预组侧脑室周围白质可见散在炎症细胞浸润，细胞水肿，神经元核固缩，神经元变性，部分呈空泡状，伴小胶质细胞增生；术后7 d，PVL模型组侧脑室周围白质病理改变较前加重，组织疏松明显，见多发液化灶、筛状软化灶形成；术后14 d，PVL模型组软化灶较前减少，但左侧侧脑室、第三脑室明显扩大，并伴囊腔、胶质瘢痕形成，脑组织、胼胝体萎缩和神经纤维紊乱。术后各时点，rEPO干预组脑室周围白质病理改变均较PVL模型组轻，假手术组脑室周围白质细胞形态及分布正常。见OSID码图2。

2.1.3 髓鞘组织LFB染色结果 术后3 d，PVL模型组及rEPO干预组可见髓鞘水肿，部分髓鞘断裂，伴空泡形成。术后7 d，PVL模型组及rEPO干预组髓鞘水肿加重，髓鞘区见大量空泡形成，髓鞘染色较术后3 d变浅，但rEPO干预组髓鞘病理改变轻于PVL模型组。术后14 d，PVL模型组髓鞘水肿较前减轻，神经纤维走行呈条索状或网状；rEPO干预组髓鞘较清晰，神经纤维走行较规则。假手术组在术后各时点髓鞘结构清晰，神经纤维走行清晰而规则。见OSID码图3。

2.2 三组新生鼠脑室周围白质组织CNPase表达比较 各组术后同时点比较，新生鼠脑室周围白质组织CNPase表达假手术组＞rEPO干预组＞PVL模型组（P均＜0.05）；同组术后各时点比较，rEPO干预组及PVL模型组脑室周围白质区CNPase表达术后14 d＞术后3 d＞术后7 d（P均＜0.05）；假手术组术后3 d＞术后7 d、14 d，术后7 d与14 d比较差异无统计学意义。见表1。

表1 三组新生鼠脑室周围白质区不同时间点CNPase表达水平比较（±s）

表1 三组新生鼠脑室周围白质区不同时间点CNPase表达水平比较（±s）

注：与同组术后3 d比较，a P＜0.05；与同组术后7 d比较，b P＜0.05；与假手术组同时点比较，c P＜0.05；与PVL组同时点比较，d P＜0.05。

组别假手术组rEPO组PVL模型组F P n 8 8 8术后3 d 116.05±11.79 66.04± 5.16d 46.92± 5.30c 122.33＜0.01术后7 d 102.55±10.05a 45.76± 3.30ad 32.76± 3.86ac 260.56＜0.01术后14 d 101.79±14.09a 76.66± 9.90bcd 61.50± 3.69abc 32.10＜0.01 F 3.52 43.82 87.69 P 0.04＜0.01＜0.01

2.3 三组新生鼠脑室周围白质组织NG2表达比较 各组术后同时点比较，新生鼠脑室周围白质组织NG2表达rEPO干预组＞PVL模型组＞假手术组（P均＜0.05）；术后随着时间推移，三组脑室周围白质区NG2表达水平逐渐下降（P均＜0.05）。见表2。

表2 三组新生鼠脑室周围白质区不同时间点NG2表达水平比较（±s）

表2 三组新生鼠脑室周围白质区不同时间点NG2表达水平比较（±s）

注：与同组术后3 d比较，a P＜0.05；与同组术后7 d比较，b P＜0.05；与假手术组同时点比较，c P＜0.05；与PVL组同时点比较，d P＜0.05。

组别假手术组rEPO组PVL组F P n 8 8 8术后3 d 56.94±2.30 73.62±4.60d 63.09±4.06c 36.63＜0.01术后7 d 44.88±1.15a 56.96±2.03ad 48.50±0.28ac 166.56＜0.01术后14 d 39.61±1.70ab 53.96±2.88ad 35.96±0.87abc 180.20＜0.01 F 141.86 80.33 255.46 P＜0.01＜0.01＜0.01

3 讨论

PVL是早产儿脑损伤的主要类型，人类PVL主要发生于胎龄23～32周，此阶段以pre-OLs为主，也是髓鞘形成关键期［9］。CRAIG等［10］研究显示，出生2～5 d大鼠的脑组织处于pre-OLs阶段，与早产儿所处的发育阶段相似；因此，出生3 d的大鼠符合人类早产儿PVL发病时间，故可用于PVL动物模型制作。本研究发现，PVL模型组及rEPO干预组脑室周围白质组织均可见脑细胞水肿、坏死，神经元死亡，软化灶及胶质瘢痕形成，左侧脑室扩大、胼胝体变薄；LFB髓鞘染色显示PVL模型组髓鞘断裂、神经纤维走形紊乱，上述改变均符合PVL脑组织病理改变，可进一步证实PVL建模成功。另外，本研究发现，PVL模型组、rEPO干预组术后7 d脑室周围白质损伤、脱髓鞘病变最为明显，其可能因为该时段是新生鼠大量OLs成熟和髓鞘开始形成的关键时期，而两组新生鼠由于前期缺血、缺氧导致大量OLs损伤和髓鞘化障碍，此时其本身的代偿机制又尚未发挥保护作用［10］。

PVL的主要病理特征是缺血性损伤抑制OLs分化成熟，导致髓鞘形成、成熟障碍。OLs的发育有三个连续阶段：OLs祖细胞、pre-OLs及成熟OLs［9］。NG2是pre-OLs特异性细胞标志物。研究显示，pre-OLs对缺氧、缺血损伤高度敏感，当发生脑损伤时，pre-OLs可代偿性增殖分化，促进OLs成熟和髓鞘化形成［11］。CNPase作为OLs和髓鞘标志物，任何原因导致的pre-OLs分化及成熟障碍、髓鞘再生障碍都将使CNPase表达减少［12］。因此，通过动态监测CNPase、NG2表达水平，可反映OLs再生及髓鞘形成情况。本研究显示，随着时间推移，各组脑室周围白质组织NG2表达逐渐降低，提示随着新生鼠日龄增长，pre-OLs逐渐分化为成熟的OLs，这符合pre-OLs的发育规则；PVL模型组脑室周围白质组织NG2表达高于假手术组，可能与pre-OLs在脑组织遭受缺血、缺氧损伤后代偿性增殖分化以补充OLs，为后期髓鞘形成提供保障有关。本研究观察到CNPase在各组脑室周围白质组织均有表达，且在假手术组脑室周围白质组织表达最多。随着新生鼠日龄增长，少突胶质细胞逐渐分化成熟并形成髓鞘，CNPase表达逐渐趋于稳定［10］。本研究结果同样显示，假手术组CNPase表达在新生鼠术后3 d后减少，而在术后7 d与14 d的差异无统计学意义。PVL模型组脑室周围白质组织CNPase表达最少，提示缺血、缺氧损伤可导致OLs成熟障碍及脑组织脱髓鞘样变。EPO是新生儿期大脑功能发育的重要生长和保护因子［4］。研究发现，高剂量rEPO（5 IU/g）可通过血脑屏障，在注射rEPO 2.0～2.5 h后，大鼠脑脊液内的浓度即可达到神经保护作用；外源性EPO可显著减少凋亡细胞和减轻脑水肿，并可通过促进OLs成熟以及髓鞘形成来发挥其保护作用［13-15］。本实验结果显示，经rEPO治疗后的PVL新生鼠在术后3、7、14 d脑水肿、脑室扩大均减轻，髓鞘断裂少见，神经纤维走形尚清晰，提示rEPO可减轻PVL新生鼠脑组织细胞水肿、脑室扩大及脑组织萎缩等病理性损伤，并可促进髓鞘修复。rEPO干预后的PVL新生鼠脑室周围白质区CNPase表达明显升高，提示外源性EPO可促进CNPase表达，从而促进OLs分化和髓鞘形成，与ZHU等［15］研究结果一致。rEPO干预组脑组织NG2表达水平明显升高，NG2表达量在术后7、14 d均高于PVL模型组，提示rEPO可促进pre-OLs增殖分化，促进OLs成熟。由此可见，我们认为rEPO可通过增加OLs及pre-OLs促进OLs成熟及髓鞘形成，从而减轻脑缺氧、缺血引发的新生鼠PVL。