金针菇源维生素D2复合片剂对去卵巢骨质疏松大鼠血清生化指标、骨及脏器影响

胡代花，杨旭，陈旺，冯自立，张嘉昕，李翠丽，隋香菊，祁珊珊*，雒志恒

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院维生素D生理与应用研究所，陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种全身性骨骼疾病，主要特征为低骨量和骨组织的微细结构退变，易导致骨脆性增加和骨折的发生。妇女绝经后因卵巢功能衰退，血液及组织内的雌激素水平大幅降低，破骨细胞活跃程度增强，骨转化率加快，骨吸收大于骨形成，引发绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。统计数据显示，PMOP发病率高达60%～70%，严重威胁患者的健康和生活质量[1-3]。

维生素D2（VD2）作为维生素D家族的重要一员，与维生素D3（VD3）具有相近的生物功能，均能调节钙磷的代谢，促进骨骼的健康，在临床上用于预防和治疗佝偻病、骨质软化、骨质疏松等疾病[4-6]。人体自身不能合成VD2，需通过食物补充。高营养价值的食用菌中不含VD2或含量极低，但却含有较高的VD2前体——麦角甾醇[7-8]。在紫外照射下，食用菌中麦角甾醇发生B环开环生成VD2前体，再经1，7-氢迁移和重排周环反应生成VD2。食用菌通过紫外辐照处理，其VD2含量大幅度提高[10-18]，可作为补充VD的食品及药品的重要天然原料。关于高含量VD2食用菌的体内生物利用率，文献多对正常大鼠或缺乏VD人群补充不同剂量的紫外照射食用菌，从血清Ca2+浓度、25-羟基-VD2含量、甲状旁腺激素表达水平、股骨密度、胫骨厚度、Ca2+转运基因在十二指肠和肾脏中的表达等指标进行研究，结果表明通过紫外照射提高VD2含量的食用菌具有较好的生物利用度[19-24]，但有关其对骨质疏松症的预防和治疗效果尚未见研究报道。

为了进一步明确高含量VD2食用菌对骨质疏松症的预防和治疗效果，本文以去双侧卵巢骨质疏松大鼠为模型，以所研制的金针菇源VD2复合片剂为材料，比较大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，StrACP）等生化指标及脏器指数、子宫和骨组织等形态病理学指标变化，旨在为食用菌源VD2产品的研发及高值化应用，以及绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供理论依据和重要参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Nikon Ti倒置荧光显微镜：尼康光学仪器有限公司；BIOTEK EPOCH酶标仪：美国博腾仪器有限公司；1200紫外分光光度计：岛津仪器有限公司；RM2235石蜡组织切片机：莱卡显微系统有限公司；YT-7C摊烤片机：孝感市亚光医用电子技术公司；5424型低速离心机：德国Eppendorf有限公司；ZNCL-BS磁力搅拌器：常州梅香仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平：赛多利斯仪器有限公司；DHP-200电热恒温培养箱：河北大宏实验仪器有限公司。

VD2滴丸：国药控股星鲨制药有限公司；金针菇源VD2复合片剂：陕西理工大学维生素D生理与应用研究所自制；微板法钙试剂盒、磷钼酸法磷测试盒、碱性磷酸酶试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物

健康雌性3月龄未孕SD大鼠24只，由西安交通大学实验动物中心提供，体重210 g～258 g，分笼饲养，自由饮水，适应性饲养1周后进行实验。

1.3 双侧卵巢去除手术

将24只SD大鼠分为假手术组（Sham组）和去卵巢组（OVX组），其中Sham组6只，OVX组18只。OVX组大鼠参考文献方法实施卵巢去除手术[25-26]。Sham组大鼠实施假手术，术后1周对OVX组大鼠进行阴道涂片，连续5 d，观察去卵巢组不出现动情周期，表明卵巢去除成功。

1.4 动物分组及给药

手术后1周，对OVX组进行分组，分别是OVX+市售 VD2组（OVX+VD2组）、OVX+金针菇源 VD2复合片剂组（OVX+MVHP组）和OVX组，每组6只。其中Sham组每只大鼠每次灌胃1 mL纯花生油；OVX组每只大鼠每次灌胃1 mL纯花生油；OVX+VD2组每只大鼠每次灌胃含市售VD2滴剂的花生油（15 IU/mL）1 mL；OVX+MVHP组每只大鼠每次灌胃含金针菇源VD2复合片剂的花生油（15 IU/mL）1 mL。隔天灌胃，持续给药16周。

1.5 脏器指数测定

连续给药16周后将大鼠处死并称重，打开大鼠腹腔，取出大鼠心脏、肝、脾、肾和子宫等脏器分别进行称重，计算各脏器指数。脏器指数=脏器湿重/大鼠体重。

1.6 血清生化指标测定

连续给药16周后采集大鼠眼眶静脉血，4000r/min离心10 min，分离血清，-20℃冰箱保存备用。血清钙含量、血清磷含量、血清碱性磷酸酶活性、抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定参考试剂盒方法进行。

1.7 骨组织样品采集及病理学分析

连续给药16周后处死动物，取其左侧胫骨和股骨，3.7%多聚甲醛4℃固定24 h，磷酸盐缓冲液漂洗，10%乙二胺四乙酸（pH 8.0）4℃，脱钙21 d。将脱钙标本以磷酸盐缓冲液充分漂洗，依次脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片（5 μm），苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）。显微镜观察各组大鼠骨组织形态[26]。

1.8 子宫病理组织形态学观察和形态计量学检测

取各组大鼠右侧子宫角组织，依次脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片（5 μm），HE 染色。光学显微镜 4×10倍镜下观察子宫管径厚度，10×10倍镜下观察子宫固有层腺体数量，40×10倍镜下观察子宫黏膜上皮厚度，并分别随机选择5个视野拍照保存，应用Image Pro Plus软件对子宫管径厚度、子宫黏膜上皮厚度进行形态计量学测定[26]。

1.9 数据处理与分析

试验结果均以“平均数±标准差”表示，试验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用Tukey’s HSD进行方差分析（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 血清钙和磷含量测定结果

各实验组大鼠血清钙和磷含量测定结果见图1。

图1 不同处理组大鼠血清钙和磷浓度（n=6）Fig.1 Serum calcium and phosphorus concentrations in rats in different treatment groups（n=6）

图1结果表明，与OVX组相比，OVX+MVHP组血清钙浓度显著升高（p<0.05）。Sham 组、OVX+VD2组血清钙浓度与OVX组、OVX+MVHP组均无显著差异（p>0.05）；与OVX组相比，Sham组、OVX+MVHP组血清磷浓度均无显著差异（p>0.05），而OVX+VD2组血清磷浓度显著下降（p<0.05）。

2.2 血清AKP与StrACP活性测定结果

各实验组血清AKP与StrACP活性测定结果见表1。

表1 各组大鼠血清中AKP、StrACP测量结果（n=6）Table 1 The AKP and StrACP in rats seurm of different groups（n=6）

表1结果表明，Sham组、OVX+VD2组和OVX+MVHP组血清中AKP活性与OVX组相比均显著降低（p<0.05），但各组血清StrACP活性与OVX组相比均无显著差异（p>0.05）。OVX+VD2组和OVX+MVHP组血清StrACP活性与Sham组相比均显著降低（p<0.05），但二者之间无显著差异（p>0.05）。

2.3 脏器指数测定结果

各组大鼠主要脏器指数测定结果如表2所示。

表2 各组大鼠脏器指数结果比较（n=6）Table 2 The major organ index of rats in different groups after operation（n=6）

与OVX组相比，OVX+MVHP组肝脏指数、肾脏指数、子宫指数显著升高（p<0.05），心脏指数显著降低（p<0.05），而脾脏指数无显著差异（p>0.05）。与OVX+VD2组相比，OVX+MVHP组肝脏指数、脾脏指数、子宫指数显著降低（p<0.05），肾脏指数显著升高（p<0.05），而心脏指数无显著差异（p>0.05）。

2.4 子宫组织病理学观察

子宫组织病理形态学观察结果见图2。

如图2所示，Sham组大鼠子宫断面结构在光镜下主要呈现壁厚腔窄的形态，单层柱状上皮规则排列，子宫肌层较厚，各层肌纤维相互交织，固有层分布有腺体和血管。与Sham组相比，OVX组子宫管径厚度明显变薄，子宫腔径厚度也明显增加，子宫黏膜上皮厚度明显变小，固有层子宫腺体减少；与OVX组相比，OVX+VD2组和OVX+MVHP组子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度明显增加，子宫腔径厚度明显减小，肌层和子宫内膜显著增厚，固有层子宫腺体增多。

图2 子宫组织病理形态学观察Fig.2 Histopathological observation of uterus of rats in different groups

2.5 子宫形态计量学结果

子宫组织形态计量学结果如表3所示。

表3 各组大鼠子宫形态计量学指标测量结果比较（n=6）Table 3 The measurements of uterine morphometric indicators in rats of different groups（n=6）

与Sham组相比，OVX组子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著降低（p<0.05），子宫腔径厚度显著升高（p<0.05）；与OVX组相比，OVX+MVHP组子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著升高（p<0.05），而子宫腔径厚度显著降低（p<0.05）；OVX+MVHP组与OVX+VD2组子宫管径厚度、子宫黏膜上皮厚度及子宫腔径厚度均无显著差异（p>0.05）。

2.6 骨组织病理学观察

骨组织病理形态学观察结果如图3所示。

图3 各组大鼠胫骨和股骨病理学观察Fig.3 Pathological observation of femora and tibia of rats in different groups

Sham组股骨的骨小梁致密且较宽、排列整齐并连接成网；与Sham组相比，OVX组股骨的骨小梁出现断裂，结构扭曲不完整，大部分不能连接成网状；与OVX组相比，OVX+MVHP组骨小梁有所恢复，骨小梁间隙变小，排列尚整齐并相互连接。Sham组胫骨骨髓腔较小，骨小梁致密且相互连接；与Sham组相比，OVX组胫骨骨髓腔变大，骨小梁松散；与OVX组相比，OVX+MVHP组骨髓腔变小，骨小梁断裂情况改善。

3 结论与讨论

切除雌性大鼠双侧卵巢所致的骨质疏松，能够正确模拟女性由于雌激素缺乏而引起骨质疏松的临床特征，是学术界目前公认的研究绝经后骨质疏松症的动物模型，亦是绝经后骨质疏松症研究的“金标准”。本文以去双侧卵巢骨质疏松大鼠为模型，以所研制的金针菇源VD2复合片剂为材料，比较了不同处理组大鼠血清钙、磷、AKP、StrACP等生化指标及脏器指数、子宫和骨组织形态病理学等指标变化，结果表明，与Sham组比较，OVX组大鼠子宫系数、组织病理学、形态计量学及骨组织病理学均有显著差异，说明去卵巢大鼠骨质疏松模型建立成功。与OVX组相比，OVX+MVHP组血清钙浓度显著升高（p<0.05），AKP浓度显著降低（p<0.05），而血清磷和StrACP浓度无显著差异（p>0.05），心、肝、肾、子宫等脏器指数差异显著（p<0.05），而脾脏无显著差异（p>0.05）；子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著升高（p<0.05），子宫腔径厚度显著降低（p<0.05），股骨和胫骨骨小梁致密，小梁间距和骨髓腔变小。初步表明金针菇源VD2复合片剂对绝经后骨质疏松症具有一定的预防和治疗作用，研究结果为紫外照射提高VD2含量的食用菌的生物利用度，以及绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供理论依据和重要参考。