煤矸石对鲫鱼体内微量元素含量及组织结构的影响

刘丽丹 ，周瑶 ，孙庆业

1.安徽大学资源与环境工程学院，安徽 合肥 230601；2.湿地生态保护与修复安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601

煤矸石是煤碳开采和洗选过程中产生的副产品，排放量占开采量的10%—15%，是矿区储存量最大、占地最广的固体废物（田莉等，2020）。露天堆放的煤矸石不仅占用土地资源，而且会释放多种有害物质如硫化物、微量元素等，其中微量元素的释放主要通过淋溶作用（Zhou et al.，2014；邓君，2019）。在富有游离氧气的降雨作用下，煤矸石中的硫化铁发生氧化，生成[Fe2(SO4)3]和硫酸，使煤矸石中的碳酸盐和氢氧化物溶解，致微量元素以硫酸盐形式随溶液析出、迁移，如Cu、Pb、Zn等（刘桂建等，2001）。堆积在采煤沉陷区周边的煤矸石，微量元素析出后可通过地表径流等途径进入水体，一方面使水体微量元素含量升高，对沉陷区附近的地表水和水源、土壤等产生污染（Davies et al.，2011；Sahoo et al.，2014；Villenuve et al.，2017）；另一方面微量元素进入生物体内后，很难通过代谢作用排出体外，在生物体内积累，通过食物链作用向较高营养级生物迁移，有致癌、致突变风险，甚至威胁人类健康（Hook et al.，2002；Mann et al.，2009；Rose et al.，2015；Strong et al.，2016；Dipark，2017）。

水中微量元素对鱼体组织的影响国内外已有较多研究。Khan et al.（2015）进行了Pb、Cd对鲫鱼毒性的研究，发现水体中Pb、Cd可对鲫鱼肝脏和血液产生影响，表现为贫血、肝肾功能损害等；王瑞霖等（2015）研究滦河流域鲫鱼体内Cu、Zn、Pb、As、Cd的分布特征，指出水体中Cu、Cr主要蓄积在鲫鱼肝脏，Zn、Pb、Cd主要富集在鳃部，As的蓄积器官随地域变化而变化；唐建勋等（2012）研究Pb、Cu在鲫鱼卵巢的富集和卵细胞损伤效应，发现水体中Pb、Cu可对卵巢和卵细胞产生影响，卵巢中Pb、Cu的富集量随水体中离子浓度的增加和时间的延长而加大，表现为卵巢逐渐萎缩、卵细胞受损继而失去代谢能力，最终引起卵巢功能破坏或丧失。

煤矸石中除含有微量元素外，还含有多环芳烃、硫化物等（Wang et al.，1999；欧阳赛兰等，2013）。目前关于煤矸石中微量元素污染对鱼体的影响，大多是器官蓄积能力差异和风险评价，对鱼体组织结构的影响较少被关注（Belton et al.，2014；杨军英等，2015；闫永峰等，2015）。因此本研究以鲫鱼为试验动物，通过水池养殖试验，探讨煤矸石对鲫鱼体内微量元素含量及组织结构的影响，为采煤沉陷区的湿地生物保护及周边居民健康提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

安徽大学磬苑校区温室养殖池作为试验池，容积均为9×103L。模拟采煤沉陷区现状，在养殖池底部铺满10 cm左右厚的风干无污染土壤，浸泡7 d后投放已发芽的马来眼子菜（Potamogeton wrightii）、苦草（Vallisneria）等水生植物；25—40个圆顶珠蚌（Uniodouglasiae）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata）等水生动物，保证一定的物种丰富度。

30 d左右，待生物适应稳定后，投放5—10条鲜活无污染鲫鱼。对安徽省阜阳市颍上县谢桥煤矿进行实地调查，估算多个塌陷塘体积与周边矸石堆质量、占地面积之间的关系，将筛选风干后的煤矸石，按照0 kg（空白对照组A）、60 kg（实验组B）、140 kg（实验组C）称质量，于2019年9月用网兜沉入塘底。

1.2 样品采集和处理

水样于2019年9月和2020年9月采集两次，采集深度为0.5 m，每个试验池各3个平行；同时2020年9月采集个体大小、质量相似、活力较强的鲫鱼样本各5—10条。

1.3 上覆水理化指标检测

上覆水pH检测使用pH计，氨氮测定参照《水质 铵的测定（GB/T 7479—1987）》、总氮测定参照《水质 总氮的测定（GB/T 11894—1989）》、CODMn测定参照《水质 高锰酸钾指数的测定（GB/T 11892—1989）》。

1.4 微量元素含量检测

上覆水微量元素质量浓度检测：取水样50 mL，各3个平行。用浓硝酸和过氧化氢消解，定容至50 mL后使用ICP-MS对Cu、Cd、As、Zn、Pb进行检测（张武，2018）。各元素加标回收率在95%—115%。

鲫鱼组织微量元素质量分数检测：取冻干磨碎后的样品0.2 g，各3个平行。硝酸和过氧化氢浸泡过夜后进行消解、定容（段元慧等，2015）。使用ICP-MS对 Cu、Cd、As、Zn、Pb进行检测。采用扇贝标准样品（GBW-10024）作标准品，回收率在92%—103%。

1.5 鲫鱼不同组织结构观察

取鲜活鲫鱼相同部位组织，经吸水纸擦干后，用 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后进行 HE染色，中性树胶封片，于显微镜下观察。

1.6 数据分析

数据以平均值±标准差表示。应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Excel 2016软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 上覆水理化指标与微量元素质量浓度

比较上覆水的基本理化指标，发现自2019年9月—2020年9月，对照组与试验组pH值均在7.3—7.81，呈中性，是由于煤矸石中的一些离子化合物发生水解反应，消耗H+，使周边水体pH逐渐呈现弱碱性（安茂国，2019）。氨氮质量浓度在0.011—0.157 mg·L−1、总氮质量浓度在 0.192—0.573 mg·L−1、CODMn质量浓度在 6.188—9.942 mg·L−1。采用单因子水质标识指数和综合水质标识指数对上覆水氨氮、总氮、CODMn进行污染程度评价（徐祖信，2005）。结果表明，未造成上覆水营养盐污染，水质整体可达到Ⅲ类综合水质标准，符合水产养殖的渔业水域的标准。

表1表明，微量元素质量浓度表现为 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd，其中 Cu、Pb质量浓度随水/煤矸石比的增大而增加，在C组中最高。可见由于时间和水/煤矸石比的增加，溶质浓度增大，溶液浓度也会随之增加。肖利萍等（2006）研究煤矸石：水固液比为 1∶5、1∶10和 1∶20时，固液比越大，浸泡时间越长，煤矸石中溶解释放的污染物总量越多。本研究中As含量随pH值增大而减小，B组pH值低于C组，As含量也略高。冯启言等（2002）通过研究兖州煤矸石的淋滤条件，指出pH为4和8时，As质量浓度分别是 0.082、0.010 mg·L−1。pH 值越低、酸性越强的淋溶液可增加煤矸石中 As的析出量也被其他研究所证实（刘桂建等，2001）。上覆水 Cd质量浓度随时间、水/煤矸石比的增加而降低，可能是由于Cd在pH＞7的水溶液中，形成Cd(OH)2沉淀，导致含量降低（安茂国，2019）。本研究所测微量元素结果与其他研究相比，元素变化相同，但含量却较低，可能有两方面原因：一是水/煤矸石比的不同，二是煤矸石渗出方式。本研究使用无污染水体作淋溶液，水/煤矸石质量比为300∶1和300∶7，不同于酸溶液淋滤条件，无法快速增加污染物释放速率，远低于肖利萍等（2006）研究中煤矸石的固液比。本研究中煤矸石一直浸泡在水体内，不同于动态淋滤过程，无法持续进行间歇复氧，改变微量元素含量及存在形态，释放大量污染物（王晖等，2006），这可能是导致水体微量元素含量较低的主要原因。

表1 上覆水微量元素质量浓度Table 1 Mass concentration of trace elements in overlying water μg·L−1

2.2 鲫鱼不同组织微量元素质量分数

鲫鱼不同组织微量元素质量分数见表 2。鲫鱼属底层鱼类，以植食性饲料为主，通过取食周边浮游植物和藻类、或鳃体的吸附过滤作用富集微量元素，在身体中不断积累（张旭升，2016）。肌肉作为鲫鱼主要食用部分，组织内微量元素安全问题尤为重要。在B、C组中，肌肉Cu、Cd、Zn、Pb质量分数显著增加（P＜0.05），表现为 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd。鲫鱼主要以浮游藻类等作为饵料，浮游藻类不仅可以作为监测重金属污染水体的有利指示物，自身也可吸附和转运一定的微量元素（严如玉等，2020）。上覆水中的微量元素被浮游藻类吸附后，通过食物链作用进入鲫鱼体内，造成肌肉中微量元素的富集。与A组相比，上覆水和肌肉Cu、Zn、Pb含量均有增加，且微量元素含量变化一致，表现为 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd。颜世铭（2008）和李涛（2014）发现生物体内微量元素含量与环境中该元素含量呈正比，并认为鲫鱼组织中微量元素含量与摄食环境和生存背景密切相关。鳃是鱼类的呼吸器官，水环境中的微量元素通过呼吸作用或鳃表面的粘液附着进行富集，B、C组中，鳃 Cu、As、Zn、Pb质量分数显著增加（P＜0.05），表现为 Zn＞Cu＞Pb＞As＞Cd。与A组相比，上覆水和鳃中Cu、Zn、Pb、As含量也均有增加，其中Pb、As质量分数在鳃中表现为Pb＞As，与上覆水和肌肉组织含量表现不同，可能与鳃对微量元素的富集能力有关（蔡深文等，2011）。王瑞霖等（2015）发现鲫鱼鳃对 Pb、As的富集能力大于肌肉，主要受不同器官蓄积能力差异的影响。

表2 鲫鱼不同组织重金属质量分数Table 2 Mass fraction of trace elements in different tissues of Carassius auratus mg·kg−1

肌肉和鳃中Zn、Cu质量分数远高于Cd、As、Pb，和生命非必需元素相比，生物体更易吸收生命必须元素（Uluturhan et al.，2007；楚禄建等，2020）。5种微量元素中，肌肉、鳃的Cd含量均最低，鳃中Cd含量大于肌肉，可能与Cd具有强组织亲和性相关，低剂量的Cd就会对生物产生巨大毒害，鱼体生活在Cd污染的水体中，鳃最先受到影响，组织细胞形态也会受到危害（王志芳等，2019）。本研究中鳃微量元素含量大于肌肉，表明鳃对微量元素的富集能力较强，Pb在鲫鱼不同组织的分布规律为：鳃＞肌肉。鱼体不同组织对Pb的蓄积能力不同，内脏和鳃对Pb的富集能力大于肌肉（唐建勋，2009；王田田等，2015；倪明龙等，2019）。鲫鱼通过鳃从外界获得溶解氧，主要滤食浮游藻类（楚禄建等，2020），通过呼吸、吸附等作用富集微量元素，导致鳃中微量元素质量分数增加。两种组织中微量元素含量，均随水/煤矸石比和水体微量元素含量的上升而增加。

2.3 鲫鱼不同组织结构变化

2.3.1 鲫鱼肌肉组织结构变化

鲫鱼背部肌肉组织横切见图 1。肌肉组织结构受多种因素影响，如饵料、代谢等外界环境。A组鲫鱼背部肌肉组织结构完整，未产生组织学病变。B组肌内膜轻度裂解，导致肌纤维细胞核分布呈部分离散状态；肌纤维轻度坏死呈分裂像，结缔组织增生，鲫鱼肌肉组织结构已受到影响。C组肌肉组织完整性最低，出现较多碎裂细胞，肌内膜裂解程度加深，肌纤维细胞核数目少、离散程度大，结缔组织增生严重，鲫鱼肌肉组织结构受到严重影响。随着水/煤矸石比和组织中微量元素质量分数的增加，肌肉组织学病变程度加深。细胞完整性降低，细胞核数目不断减少、分布离散程度逐渐加深。微量元素含量较高的肌肉组织中，肌纤维坏死情况和结缔组织增生情况更严重。

图1 鲫鱼肌肉组织横切（×200）Fig.1 Cross section of Carassius auratus muscle tissue (×200)

与A组相比，上覆水和肌肉中微量元素含量逐渐增加，肌肉组织病变程度也加深，其中上覆水Zn、Cu、As质量分数高于Pb、Cd，与肌肉变化一致。水体微量元素可在生物组织中富集，导致组织微量元素含量升高，对机体不同器官，如卵细胞、肌肉等产生危害，表现为卵细胞受损、卵巢萎缩，肌纤维直径和密度减少、肌纤维束的纹络形态受到损伤等（唐建勋等，2012；李涛，2014）。但由于煤矸石中还含有其他污染物（如多环芳烃），也具有生物累积性，污染物进入生物体后，可导致肌肉、肝脏等组织发生病变，表现为细胞破裂、溶解，胞质中空泡化程度加重等。肌肉组织病变是否与煤矸石中其他污染物有关，有待于进一步研究（陈晶，2005；蒋闰兰等，2014）。

2.3.2 鲫鱼鳃组织结构变化

鲫鱼鳃组织横切见图 2。鲫鱼的鳃进行着气体交换、滤食和排泄等重要生理过程（Samajdar et al.，2017），是鱼类响应环境变化的重要器官。它受多种因素的影响（Miron et al.，2008；Rojas et al.，2013；刘娟娟等，2015），其形态变化可直接影响鱼类存活（Samajdar et al.，2017）。A组鲫鱼的鳃组织结构正常，表现为鳃丝间距均匀，鳃丝内部可见一棒状软骨无异常，鳃小片呈柳叶状有序地位于鳃丝两侧。B组鳃丝间距增大、末端膨大，鳃小片逐渐脱落导致数目减少，垂直于鳃丝两侧并轻度弯曲；鳃丝软骨轻度变薄，开始出现组织学病变。C组中鳃丝间距不等，末端膨大情况加重，鳃小片严重弯曲、无规则扭曲排列在鳃丝两侧，鳃丝末端鳃小片出现脱落；鳃丝软骨组织变薄程度加深。

图2 鲫鱼鳃组织横切（×200）Fig.2 Cross section of Carassius auratus gill tissue (×200)

B、C组中，上覆水和鳃的微量元素含量不断增加，鳃病变程度也逐渐加深，上覆水和鳃中Pb、As含量表现不同，可能与鳃对微量元素富集能力的差异有关（王瑞霖等，2015）。鳃组织病变程度随上覆水、组织微量元素含量的增加而加重，在微量元素污染的水体中，鳃组织可对微量元素进行富集，并出现鳃丝排列混乱、断裂融合等现象（吴林德等，2015）。但煤矸石中含有的多环芳烃等污染物，也会导致生物体鳃组织发生病变，出现鳃纤毛和微绒毛脱落，鳃丝上皮细胞排列不规则、细胞坏死等现象，严重影响鳃丝呼吸功能。鳃组织病变与煤矸石中其他污染物的关系，需再进行深入研究（吴玲玲等，2007）。

3 结论

试验期间，煤矸石未对上覆水产生营养盐污染，上覆水水质整体可达到地表水Ⅲ类标准，符合水产养殖渔业水域的标准。随着水/煤矸石比率由300∶1 增至 300∶7，鲫鱼肌肉和鳃中 Zn、Cu、Cd、Pb质量分数显著增加（P＜0.05），其中Zn、Cu质量分数最高、Cd质量分数最低，鳃对微量元素的富集能力大于肌肉；肌肉组织中微量元素的质量分数表现为 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd，鳃组织中微量元素的质量分数表现为 Zn＞Cu＞Pb＞As＞Cd。

在水/煤矸石质量比率为 300∶1，肌肉中 Cu、Zn、Cd、Pb、As平均质量分数为 1.501、105.718、0.005、0.136、0.388 mg·kg−1，鳃为 1.919、222.587、0.010、0.908、0.265 mg·kg−1时，组织开始出现病变，病变程度随水/煤矸石比的增加而加重。肌肉组织中细胞完整性降低、细胞核数目减少、分布离散程度加深；鳃组织中鳃丝间距增大，鳃丝软骨变薄，鳃丝末端鳃小片出现脱落，鳃小片弯曲程度加深、呈无规则排列。