老年病样本库生物安全管理

傅蕾 保志军 苟海昕

(1复旦大学附属华东医院中心实验室，上海 200040;2上海市老年医学临床重点实验室;3复旦大学附属华东医院伤外科)

随着生命科学研究进入了功能基因组时代，人类对疾病状态分子机制的不断研究，疾病诊断和治疗由传统的疾病治疗模式进入转化医学模式。规范化的老年病样本库建设和管理，提供高质量的样本和完整临床信息服务是老年医学的基础。作为质量管理体系中重要的组成部分，安全管理体系的建设和完善是样本质量的最基本保证。生物样本库生物安全日益受到重视，为确保老年病样本库在生物安全前提下正常运行，本文旨在探讨老年病样本库安全管理体系的建立和优化，工作流程的规范化管理，个人和样本存储环境的生物安全措施。

1 资料与方法

1.1研究对象 生物样本库以老年病的防治、抗衰老研究为主要方向,样本均来自复旦大学附属华东医院各临床科室住院和门诊≥60岁患者及体检人群。

1.2研究方法 专职人员培训样本库有专职人员管理。按照《实验室生物安全通用要求》(GB 19489-2008)中的实验室人员管理要求对样本库人员在实验室管理体系、安全知识及技能、实验室设施设备(包括个体防护装备)的安全使用和我院样本库设立的工作流程等方面组织培训，考核合格后上岗。样本库基础建设进行生物风险评估，同时参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》(WS233-2002)中的“实验室生物安全防护水平分级与分类”，根据我院样本库基础建设条件、处理样本的类型和操作流程等，老年病样本库按照生物安全二级实验室(BSL-2)建设〔1,2〕。样本库布局做到：①生物安全分区。按照生物安全的防护要求，老年病样本库的场地进行生物安全的分区设置，样本库内设置4～80℃预入库区。接收处理的样本统一放置临时存储区做预入库。设置清洁区、半污染区和污染区。清洁区包括办公室和耗材存储室；半污染区包括常温和低温样本存储室、超低温样本存储室；污染区包括样本接收区、样本处理区、污物处理间和质控室。各区贴醒目的标识。②人流和物流分开，人流从清洁区进入，物流(样本流)从污染区进入。在物流入口粘贴“生物污染”标识。

1.3建立和优化安全管理体系 根据中国医药生物技术协会生物样本库标准(试行) 和国际生物和环境样本库协会(ISBER) 出版的(Best Practices for Repositories) 国际公认的样本库管理规范，建立老年病样本库的质量管理控制体系文件，编制质量手册，包含 QA/QC 的所有流程。优化其中的安全管理体系文件，包括人员安全、设施及设备维护、样本安全、意外事故应急处理方案等方面内容。

1.3.1建立样本库标准化操作流程 从样本的收集、运输、处理、存储、使用等方面全程进行质量控制。样本库标准化流程见图1。

1.3.2样本采集 取样人员需佩戴外科口罩或N95口罩、工作服、乳胶手套等防护用品。采样前打印二维码贴好采样管和样本采集表。采样后样本采集管外壁和转运箱喷洒消毒液。在样品采集方面主要遵循以下几点〔3〕：①严格按照标准的采样程序；②收集足够量的生物材料以满足所有检测的需求；③对样本进行严格标识，标识内容包括来源病人的姓名、编号、标本来源、采集时间及采集人员的姓名等信息。

图1 样本库标准化流程

1.3.3样本运输和接收 转运人员按一级生物安全防护要求着装，将消毒后空转运设备置于取样处临时存放点，收集装有标本的转运箱内喷洒2 000 mg/L含氯消毒液后加盖密封与采样人员交接，填写样本交接记录。运输过程中容器保持瓶口向上，保持设备平稳，避免剧烈振荡颠簸、产生气溶胶或剧烈震动导致标本溶血。转运途中不要自行打开转运箱，如有意外发生，到样本库接收点与样本库工作人员共同处理。社区流调样本长距离运输，需用生物样本运输专用车辆。为保持样本活性,样本采集后应尽快转运至样本保藏中心处理、冻存。若需要长途运输无法在24 h内送达如跨省转运样本，保持在4～8℃。组织样本迅速分割成适当大小和份数，加入适当的样本保护液或直接放入液氮中快速冷冻保存。样本接收时，工作人员按照一级生物安全防护要求着装，样本接收时对转运箱包表面用75%酒精进行擦拭消毒后直接放置于4℃ 冰箱，将纸质样本采集表、知情同意书、放入生物安全柜中进行紫外灯照射30 min。同时核对转运清单,样本采集表、知情同意书 标签信息包括每一例患者流行病学史、姓名、登记号、采集时间等信息是否完整并签字,以便回溯。样本运输人员领取已消毒后的运输包用于再次运输样本。

1.4样本处理 样本处理和预入库进入样本库污染区做好基本防护工作，包括穿隔离衣或防护服，佩戴护目镜、手套、口罩、帽子及鞋套。对于无需开盖二次处理的样本在安全柜中消毒采样管外壁后由入库员标记，放入临时存储区-80℃隔离冰箱做预入库。对于需要分装和二次处理的样本改为二级生物安全防护〔4〕,离心后的样本管在生物安全柜中打开管帽处理、分装入已贴二维码冻存管，管外表面用75%酒精消毒擦拭后放入冻存盒内，冻存盒表面消毒后由入库员二维码扫描并在样本库信息管理系统中做预入库，放入临时存储区。使用超低温冰箱和液氮罐时，需佩戴防低温手套。特别在操作液氮罐时，还需佩戴面罩或眼罩，防止液氮飞溅至脸部或眼睛。

1.5样本数据录入和入库 老年病样本库对患者基本信息、流行病学史、病史、治疗、随访资料完整录入样本数据库，同时详细录入样本类型、位置、编码及从采集到存储入库的分析前变量(SPREC)〔5〕。在随访记录中设置预入库15 d后随访提醒，预入库30 d后如无随访信息，作为失访样本销毁处理。随访患者确定无高致病原微生物感染情况下样本入库转入存储区。

1.6样本库样本共享和转运安全 对样本库信息管理系统设置访问权限，定期数据异地备份并定期进行数据维护以保证样本库数据安全。开放样本库信息管理系统的数据接口，和医院信息管理系统连接，参与复旦大学系统网络化样本库信息管理平台建设，使样本库信息可被统一采集共享。样本出库时需签署共享使用协议书后，方可执行样本及数据出库〔6〕。样本出库转运时使用干冰或运输液氮罐。样本数据需去除姓名、性别、身份证号码、医保卡号等个人信息，保护患者隐私。尽量避免样本库数据存放到移动存储设备，如需使用移动存储设备，对数据进行加密处理，防止移动设备丢失后造成的伦理风险。

1.7建立应急预案 对样本容器破裂、操作环境污染(生物安全柜内溢洒、离心机内溢洒等)及防护设备异常(如护目镜起雾、防护设备松脱、手套破损及被液体样本喷溅等)的突发情况参照实验室生物危险物质溢洒处理指南〔4〕制定应急预案。同时制定超低温冰箱应急处置预案，最大程度降低样本库安全风险。制定火灾、水灾、冰冻、地震、人为破坏等任何意外紧急情况下的应急预案，每年至少组织所有实验室人员进行一次演习。

1.8建立样本库消毒制度 空气消毒：室内自然通风，室内紫外灯照射每天2次，每次不少于30 min。根据消毒空间大小合理应用紫外线灯管数量及有效消毒距离。物体表面及地面消毒：每日中午和下班前使用1 000 mg/L含氯消毒液对地面、操作台、仪器、门把手消毒，做好日常消毒记录,若有污染物先用消毒湿纸巾除去再用2 000 mg/L含氯消毒液〔7〕。 生物安全操作柜和转运箱消毒：二级生物安全柜操作空间每次使用前后用75%乙醇消毒,消毒后开启紫外灯照射消毒30 min。转运箱定期内部和外部清洁消毒(采用有效氯浓度为500 mg/L 的消毒液或75% 乙醇)。实验室人员消毒：工作人员操作所有标本后进行手卫生消毒,所有个人防护用具原则上一次性使用不再回收，如需要重复回收使用的污染物品(护目镜、隔离衣等)，用1 000 mg/L含氯消毒剂浸泡作用30 min〔8〕。

1.9医疗废物处置 按照《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》管理，患者所有标本当视为感染性医疗废物,医疗废物弃置于双层医疗废物包装袋内，双层封扎，用1 000 mg/L含氯消毒液喷洒袋外表面,从污物流通道转交，由医院统一处理。

2 结 果

2.1样本的收集情况 自2013年建库以来，入库病例共7 609例，血清、血浆、血细胞、核酸、总蛋白、新鲜冰冻组织和石蜡组织等类型样本共6万多份，入库病种主要为少肌症、老年冠心病、老年高血压、老年糖尿病、肝癌、肺癌、结肠癌、白塞病、帕金森病、阿尔茨海默病、脂肪肝等16个病种。约15 700份样本已出库用于临床研究，样本库样本使用率在26%左右。

2.2样本的质量鉴定 按0.1%比例随机抽取76例样本，进行DNA和RNA检测，结果显示质检样本取材准确率在95%以上，DNA样本OD260/OD280值为1.7～1.9；琼脂糖凝胶电泳检测，所有DNA完整性良好，无降解。RNA样本A260/280值均为1.9～2.0。 RNA经非变性电泳后，可见清晰的28 S和18 S条带，且28 S/18 S在1.8 ～2.0 范围内，说明RNA完整性较好，保存良好，样本质量稳定，可以满足老年病研究工作。

2.3老年病样本库 样本库在样本采集、转运、处理、保藏等工作流程中加入生物安全防护措施。建立和完善了安全管理体系文件，制定安全培训计划，对样本库工作人员进行安全培训，落实样本库生物安全监督管理措施。我院老年病样本库在样本收集、处理过程中对重要参数进行详细记录，规范地给每份样本附上分析前因素，对样本的质量进行追溯。保证了样本库生物的安全和老年病样本库的样本质量。

3 讨 论

样本库生物安全管理和安全管理体系的建立，对确保实验室工作人员、公众、样本和环境安全十分重要。2003 年以来，国家逐渐重视生物安全，相继颁发了《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》等一系列法规，标志着我国样本库生物安全管理步入科学、规范发展阶段。但由中国医药生物技术协会组织生物样本库分会(BBCMBA)开展的生物样本库质量达标检查中发现了我国生物样本库现存的一些安全管理问题，如部分样本库场地规划不分区、防护设施不完善、标识不健全等、生物安全制度不健全。样本采集与处理标准操作规程(SOP)不符合样本库实际需求，操作与SOP 不一致，无异常情况应急预案等问题。

样本库是采集和存储样本、样本临床和生物学信息一体化的重要基础研究共享平台。样本质量是生物样本库的核心，只有建设和完善质量管理体系中安全管理体系，优化样本库生物安全管理，提升样本库质量和自身能力，才能从根本上保障样本质量。

我院老年病样本库成立生物安全管理委员会，专门负责制定生物安全方案和监督其实施情况，包括样本的采集、处理、信息录入、样本存储和销毁等环节中生物安全防护措施和操作规范。建立和优化生物安全管理体系文件，制定应急预案。样本库工作人员进行规范化安全培训。在实施过程中出现问题时，进行新的风险评估，采取纠正措施，及时改进识别，根据研究者反馈将改进措施加入生物安全管理文件。特别在样本入库时，使用SPREC〔5〕记录样本分析前的操作处理各环节信息，包括样本来源和样本跟踪信息等重要参数。在质量管理体系中加入SPREC当样本出库使用或样本共享研究时，研究者可明确获得每份样本附上的分析前因素，从而有效追溯和评估SPREC对样本分子水平的影响，及对检测结果的影响,有效保证了样本的质量稳定。

老年病研究需要大样本量，单一医院的样本库无法完成样本收集。但目前我国老年医学研究生物样本库分散、样本库本身的质量不高，加之没有按统一的标准规范建库，使得样本资源难以共享。只有按统一的标准规范建立老年病样本库，建立和完善生物安全管理体系，科学管理，定期重新评估和升级修订生物安全方案并加以监督和实施，才能确保老年病样本库的生物安全。在保证样本和数据安全的前提下，才能提供高质量的共享样本资源，在盘活样本库现有存量，提高样本使用率的同时，能更好地推动老年医学及老年病研究发展和老年病样本库长期可持续发展。