NERP-1对大鼠下丘脑室旁核MNCs活动的影响机制

金鑫 张智哲 邱德来 李玉子 初春平

(延边大学 1附属医院心内二疗区，吉林 延吉 133000；2脑科学研究中心)

下丘脑室旁核(PVN) 是神经内分泌系统的重要整合中枢，主要由分泌加压素(VP)和催产素(OT)的神经分泌大细胞(MNCs)、分泌促垂体激素和调控自主神经活动的神经分泌小细胞组成〔1～3〕,其中MNCs分泌的VP和OT不仅在维持水盐平衡、血压调节、分娩和泌乳等生理功能调节中起关键作用，而且与社会行为关系密切，在亲善关系、社会认知、进攻行为、焦虑和应激反应中起重要作用〔4〕。

PVN MNCs从大脑广泛的区域接收各种传入信息，包括体液平衡和心血管状态〔5〕，其中接收来至穹窿下器官(SFO)、自视前中央核(MNPO)、终板血管器(OVLT)、脑干核〔6〕和其他下丘脑内核〔7〕的传入纤维，这些传入纤维包含兴奋性谷氨酸〔8〕和抑制性γ-氨基丁酸(GABA)能投射〔9〕，通过释放谷氨酸或GABA对PVN MNCs的活动进行兴奋和抑制调控，进而调节PVN MNCs的分泌活动〔8,9〕。

神经内分泌调节肽(NERP)-1是近年来在人甲状腺髓样癌TT细胞分离出的酰胺化肽，也是神经和内分泌系统所分泌的牛痘病毒生长因子(VGF)衍生物〔10～12〕。NERP-1在PVN中含量丰富，存在于NMCs的分泌颗粒中，与VP和OT共存〔13,14〕。NERP-1还存在于其他脑区，如视上核(SON)、弓状核(ARC)、外侧下丘脑(LH)、腹侧结节-基底膜核、视交叉上核、大脑皮层、垂体、甲状腺和胃肠道〔15～17〕。侧脑室给予抗NERP-IgGS可抑制由水负荷引起的血浆VP减少， 表明NERP可能是一种有效的内源性VP释放抑制因子，提示NERP-1在神经内分泌系统中发挥重要的调节作用。在下丘脑PVN中的NERP-1与VP与OT共存，提示NERP-1可能影响PVN MNCs活动与突触传递，参与调节MNCs的分泌功能。侧脑室或下丘脑外侧区注射NERP-2能增加大鼠摄食、耗氧量和运动活动，提示NERP-2影响中枢神经系统活动，调节能量代谢〔18,19〕。此外，Toshinai等〔20〕研究发现，NERP-1可抑制PVN MNCs的兴奋性，导致MNCs超极化，放电频率降低，但NERP-1抑制PVN MNCs兴奋性的突触机制尚不清楚。本文旨在探讨NERP-1对大鼠PVN神经分泌大细胞活动影响的突触机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 由延边大学实验动物管理中心获得，与母鼠共同饲养出生2～3周龄的雄性Wistar系大鼠。实验全部按照美国国立卫生研究院的动物保护条例进行，并由延边大学动物保护委员会监督。

1.2实验仪器 Multiclamp 20OB膜片钳放大器(Molecular Devices，USA)，Nikon LV-TV膜片钳专用显微镜(Nikon，Japan)，Clampex 10.4记录和分析软件(Molecular Devices，USA)，Digital1550AD/A数模转换器(Molecular Devices，USA)，Picospritzer1 压力注射系统(Parker Hannifin Co.Pine Brook,NJ)，MP-285微操纵器(Sutter Instrument,Novato,USA)，Gilson Minipulse 3蠕动泵(Villiers,Le BelFrance)，莱卡1200S全自动振动切片机(Leica，Germany)PB-10拉制仪(Narishige，Japan)，电子天平(Sartorius，Germany)，精密台式PH测定仪(Thermo，USA)，Westor 5520露点渗压仪(Westor，USA)，MASTER8刺激器(A.MP.L.)。

1.3实验药品 (1)KCl、NaHCO3、NERP-1、Picrotoxin，tetrodotoxin (TTX)，D-Glucose，KT5720，PKI，NaH2PO4·2H2O，Na2HPO3·12H2O等试剂订购于Sigma公司。(2)人工脑脊液(ACSF)：10 mmol/L D-glucose，125 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，25 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2。(3)电极内液：1 mmol/L EGTA，5 mmol/L KCl，120 mmol/L potassium gluconate，4 mmol/L NaCl，8 mmol/L biocytin，10 mmol/L HEPES，3.5 mmol/L MgCl2，4 mmol/L Na2ATP，0.2 mmol/L Na2GTP(pH：7.3 )。(4)生物素染色试剂：磷酸盐缓冲液，40% H2O2，ABC试剂盒，Triton100。

1.4下丘脑急性脑片制备 选取本校实验动物管理中心提供的与母鼠共同饲养的Wistar雄性大鼠(出生后2～3 w)，使用异氟烷吸入麻醉，待动物深度麻醉后迅速断头、取出脑组织。随后将取出的脑组织置于充有混合95% O2和5%CO2气体的冰冷ACSF中。ACSF含有的成分包括：NaCl(118 mmol/L),NaHCO3(25 mmol/L),D-Glucose(10 mmol/L),KCl(3 mmol/L),CaCl2(2 mmol/L)，MgCl 2.6H2O(1 mmol/L),NaH2PO4·2H2O(1 mmol/L)。渗透压为295～300 mOsM，pH值为7.25～7.35。应用振动切片机制备厚度为250 μm，含有PVN的下丘脑切片。在室温(24～25℃)条件下，将切片置于持续充有混合气体(95% O2和5% CO2)的ACSF中孵育1 h以上。

1.5全细胞膜片钳记录 使用微电极拉制仪(PB-10，Narishige，Japan)将细小玻璃管(外径:1.5 mm，Narishige，Japan)拉制成刺激电极和记录电极。在记录电极内注入10 μl电极内液，其组分包括：120 mmol/L Potassium Gluconate,8 mmol/L biocytin,5 mmol/L KCl,4 mmol/L Na2ATP，1 mmol/L EGTA,4 mmol/L NaCl，10 mmol/L HEPES,0.2 mmol/L Na2GTP,3.5 mmol/L MgCl2，pH值为7.3。记录电极的阻抗为3～7 MΩ。在电流钳下，观察神经元的自发性放电活动，研究灌流NERP-1对PVN MNCs区域神经元的自发性放电频率、静息膜电位和细胞膜特性的影响。在电压钳下，观察自发性的微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)，观察NERP-1对MNCs mEPSC的影响。只有完整记录并基线相对稳定的电生理数据才能用于最后的数据处理和统计学分析，数据储存在实验室的电脑和移动硬盘上。NERP-1、电压依存性钠离子通道阻断剂河豚毒素(TTX)、非选择性谷氨酸受体阻断剂犬尿喹啉酸(KYC)、GABAA受体阻断剂Picrotoxin通过蠕动泵给药。

1.6生物素染色 膜片钳电极内液中含有8%的生物素，电生理实验记录所用的脑切片用4%多聚甲醛进行固定24 h以上后，进行免疫组织化学染色(ABC Elitekit)、封片、显微照相，在显微镜下观察记录细胞的位置、形态学特点及轴突和树突的分布与投射情况。

1.7统计学分析 神经元的自发性放电频率的分析使用Clampfit10.4软件，mEPSCs的分析采用MiniAnalysis (6.0)软件。数据的统计学分析采用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1PVN MNCs的电生理一般特征 在电流钳记录模式下，共有63个所记录细胞符合MNCs电生理特性，被认定为PVN MNCs，这些神经元对注入电流表现出明显的外向整流特征，见图1。在电生理实验记录结束后进行固定、染色，在显微镜下观察到胞体、轴突和树突符合MNCs特征，将其确定为MNCs。

图1 MNCs的电生理特性

2.2NERP-1对PVN MNCs自发性放电活动的影响 在电流钳记录模式下(I=0 pA)，灌流100 nmol/L NERP-1，持续2 min，PVN MNCs的自发性放电活动频率显著降低，NERP-1的抑制作用大概在给药5 min后达到峰值，用ACSF冲洗后逐渐恢复至用药前的自发性动作电位的放电水平(图2A、B)。100 nmol/L的NERP-1可以导致MNCs的放电频率降低至(34.5±4.14)%，膜电位从(-50.0±1.1)mV超极化到(-53.1±1.4)mV，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2C。

2.3离子型谷氨酸受体阻断剂对NERP-1导致PVN MNCs自发性放电频率降低的影响 在电流钳下，给予KYC可导致PVN MNCs放电频率明显降低(P<0.05)，并完全阻断NERP-1对MNCs的抑制作用。在KYC存在下，给予NERP-1没有对神经元的自发性活动产生显著影响，与单独给予KYC相比没有显著差异(P>0.05)。见图3。

2.4GABAA受体阻断剂对NERP-1导致PVN MNCs自发性放电频率降低的影响 阻断GABAA受体后，PVN MNCs的自发性放电频率显著增加(P<0.05)，但没有阻断NERP-1对PVN MNCs的自发性放电的影响，见图4。

2.5NERP-1对PVN MNCs兴奋性谷氨酸能突触传递的影响 在电压依存性钠离子通道阻断剂(TTX，0.5 μmol/L)存在条件下，给予100 nmol/L NERP-1后可以明显降低MNCS 的mEPSCs频率，导致mEPSCs间隔显著增大，EPSCs概率-频率曲线右移(图5A,B);但mEPSCs的振幅较给药前后没有显著变化，概率-振幅曲线变化不明显(图5A、C)。NERP-1可导致MNCs mEPSCs频率减少到给药前的〔(63.4±3.6)%〕，与给药前〔(100.0±4.7 )%〕相比有显著差异(P<0.01)，但NERP-1对mEPSCs的振幅没有显著影响，振幅为给药前的〔(97.7±1.2)%,P<0.05〕。

(A)在电流钳记录模式下，PVN MNCs自发性放电频率的变化。(B)NERP-1诱导PVN MNCs放电频率变化的时程。(C)ACSF、NERP-1、洗出时PVN MNCs的膜电位的比较图2 NERP-1对 PVN MNCs的自发性放电活动的影响

图3 离子型谷氨酸受体拮抗剂对NERP-1诱导的PVN MNCs放电频率降低的影响

图4 GABAA受体阻断剂对NERP-1导致PVN MNCs自发性放电频率降低的影响

(A)电压钳记录模式下，在ACSF、NERP-1和洗出条件下记录PVN MNCs mEPSCs。(B)ACSF、NERP-1和洗出中PVN MNCs的累积概率-频率曲线。(C)ACSF、NERP-1和洗出中PVN MNCs的累积概率-振幅曲线图5 在TTX存在条件下，NERP-1对MNCs mEPSC的影响

3 讨 论

NERP-1在PVN中含量丰富，与VP和OT共存，在调节水盐代谢和VP释放方面起至关重要的作用。本实验应用全细胞膜片钳记录和神经药理学手段研究了NERP-1对PVN NMCs影响的突触机制，发现给予NERP-1可导致PVN MNCs放电频率显著降低并伴随明显的膜电位超极化，NERP-1导致的MNCs的放电频率降低可以被非选择性离子型谷氨酸受体拮抗剂KYC，但对GABAA受体阻断剂不敏感，此外，NERP-1显著降低MNCs的mEPSCs发生频率，但对其振幅没有显著影响。本研究结果表明NERP-1 通过突触前途径下调兴奋性谷氨酸能传入纤维终端的递质释放，降低下丘脑PVN神经分泌大细胞的兴奋性，提示NERP-1通过间接方式抑制PVN MNCs的活动与分泌。

下丘脑PVN主要由分泌VP和OT的神经分泌大细胞、分泌促垂体激素和调控自主神经活动的神经分泌小细胞组成，是神经内分泌系统的重要整合中枢〔1～3〕。PVN MNCs主要包括VP和OT神经元，分泌VP、OT等多种激素和生物活性物质，调节和维持机体的许多重要生理功能。VP和OT主要参与维持水盐平衡、血压调节、分娩和泌乳等机体功能调节，且在亲善关系、社会认知、进攻行为、焦虑和应激反应中都起重要作用〔4〕。而NERP-1在PVN MNCs的分泌颗粒中与VP和OT共同存在，而这些MNCs的轴突终止于垂体后叶，垂体后叶中的NERP-1、VP和OT亦可分泌到全身循环中，调节水盐代谢，参与血压调节及分娩和泌乳等机体功能，参与亲善关系、社会认知、进攻行为、焦虑和应激反应〔13,14〕。

NERP是一种参与体液内稳态的新型生物活性肽，以自分泌、旁分泌或内分泌方式调节其他神经肽的作用和分泌。NERP-1在神经内分泌调节、水盐代谢、摄食、能量代谢及中枢神经系统退行性疾病的发生、发展中起不可忽视的作用。侧脑室注射高渗盐水或血管紧张素Ⅱ可提高大鼠血浆VP水平，而这种作用可以被侧脑室注射NERP-1抑制。此外，侧脑室注射NERP-1 IgG抗体可以逆转急性水负荷引起的血浆VP抑制，提示NERP是调节VP分泌的内源性肽。大鼠下丘脑切片实验表明，NERP-1可逆地抑制了VP分泌和血管紧张素Ⅱ诱导的VP分泌，但NERP-1-Gly和NERP-2-Gly不能抑制VP的分泌。分泌VP的MNCs将轴突投射到垂体后叶并进入到全身的循环系统中。NERPs 还可以抑制大鼠垂体后叶的VP分泌，因此，NERPs 可能是VP分泌的内源性抑制因子〔21,22〕。

已有研究发现NERP-1可通过抑制谷氨酸能神经元向PVN神经分泌大细胞的释放从而抑制MNCs的兴奋性，但其突触机制尚不明确〔20〕。本研究是在前期研究的基础上，进一步观察了NERP-1对PVN MNCs突触传递的影响。研究结果与前期报道〔20〕相一致，发现NERP-1可引起PVN MNCs抑制，出现放电频率降低。应用了离子型谷氨酸受体阻断剂KYC，结果提示局部蠕动灌流NERP-1显著降低PVN MNCs的放电频率是通过抑制兴奋性谷氨酸能突触传入来实现的。给予了GABAA受体阻断剂Picrotoxin，结果提示NERP-1 引起PVN MNCs放电频率的降低是通过抑制兴奋性谷氨酸能突触传入而并非通过增强GABA能突触传入来实现的。在电压依存性钠离子通道阻断剂TTX的存在下，NERP-1可以明显降低敏感神经元mEPSCs的频率，但对mEPSCs振幅较没有显著影响，提示NERP-1可通过降低突触前神经元末梢的兴奋性谷氨酸能突触传递的这一可能性，从而抑制对部分PVN MNCs的兴奋性。

综上，NERP-1可显著抑制PVN MNCs的放电频率并伴随明显的膜电位超极化，NERP-1导致放电频率降低可以被非选择性离子型谷氨酸受体拮抗剂阻断，但对GABAA受体阻断剂不敏感，NERP-1 通过突触前途径抑制兴奋性谷氨酸能传入纤维终端的递质释放，降低下丘脑PVN NMCs的兴奋性，提示NERP-1间接抑制PVN MNCs的活动与分泌。