3种中国原产雄性柿种质花粉离体萌发条件优化及其活力快速检测

詹术森，陈思旭，郭大勇，张青林，罗正荣，徐莉清

(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉，430070)

柿(DiospyroskakiThunb.)为原产我国的柿科(Ebenaceae)柿属(DiospyrosL.)植物，有2 000年以上的栽培历史。根据果实能否自然脱涩及其性状遗传特点，可将现有柿品种分为两大类：完全甜柿(Pollination-constant and non-astringent，PCNA)和非完全甜柿(non-PCNA)[1]。完全甜柿可在树上自然脱涩，货架期更长，是目前柿产业发展和遗传改良的重点目标。选育具有自主知识产权的完全甜柿新品种是我国柿产业可持续发展的“瓶颈”问题。柿品种改良以有性杂交为主，但长期的自然和人工选择，现存种质中以仅开雌花和单性结实的品种较多。由于父本的缺乏，甜柿遗传改良不仅盲目性大，且已经面临近交退化的困境[2]。20世纪90年代本课题组在鄂、豫、皖三省交界的大别山区收集到一系列柿属完全雄性种质，后续研究证明其具有花粉量大、与其他柿品种亲和性好等特性，是潜在的育种材料[3-6]；“鄂柿1号”是继“罗田甜柿”后在大别山区发现的第二个中国甜柿新类型，其果实大、种子少，外观和食用品质优良[7]，最近发现其可偶开雄花[8]。此外，我们的研究还证明，上述3种雄性种质携带中国甜柿自然脱涩的显性基因，说明其具有作为杂交父本应用于甜柿遗传改良的潜力[9]。

龚榜初等发现，日本原产不完全甜柿(D.kakiThunb.)、油柿(D.oleiferaCheng)、君迁子(D.lotusL.)花粉萌发率高于40%，日本甜柿花粉萌发率低[10]。刘勇等发现日本甜柿花粉在25 ℃左右、蔗糖100～150 g/L、琼脂2～3 g/L、pH值为5～6的培养条件下，培养2～13 h花粉萌发率最高[11]。周瑞金等[12]发现“禅寺丸”花粉在附加10%蔗糖、硼酸50 mg/L的培养基，25 ℃条件下花粉萌发率达到最大值69.53%。但中国原产雄性柿种质花粉活力研究尚无详细报道。本研究以两个中国特有的仅着生雄花但带有中国甜柿自然脱涩显性基因的完全雄性种质“雄株3号”“雄株8号”和中国甜柿“鄂柿1号”花粉为试材，采用L9(34)正交试验设计和悬滴培养法，筛选花粉离体萌发最适合的蔗糖、硼酸和硝酸钙浓度组合；此外，比较碘-碘化钾(I2-KI)和TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色法在花粉活力快速检测中的应用价值，以期为中国甜柿遗传改良中花粉活力的检测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以华中农业大学柿圃“雄株3号”(D.kakiThunb.“Male 3”)、“雄株8号”(D.kakiThunb. “Male 8”)和“鄂柿1号”(D.kakiThunb.“Eshi 1”)为试验材料。晴天上午从成年树上采摘即将开放的雄花花蕾各15朵，分别装入透明密封袋中密封标记，带回实验室后用镊子取出花药，室温晾干，等花粉全部散出后，将其收集到1.5 mL离心管中，置入放有硅胶的容器中，-20 ℃保存备用。本试验花粉离体萌发和染色法检测活力均在花粉采集后3天内进行。

1.2 方法

1.2.1 花粉离体萌发条件优化 花粉离体萌发采用悬滴培养法。培养基(含1.0%琼脂，pH=5.8)蔗糖、硼酸和硝酸钙成分筛选采用L9(34)正交试验(表1)。25 ℃暗培养3 h后统计花粉萌发率，每处理重复3次，每重复观察5个视野，每视野花粉数大于50个。

表1 柿花粉离体萌发正交试验设计因素和水平

花粉萌发率=(萌发花粉数/观察花粉总数)×100%

1.2.2 I2-KI染色法测定花粉活力 用发丝蘸取少量花粉置于洁净的载玻片上，轻轻滴1～2滴I2-KI溶液，轻轻摇匀后盖好盖玻片，置于25 ℃恒温箱中，20分钟后置于光学显微镜下观察。被染成蓝色的花粉具有活性，黄褐色的花粉无活力[13]。

1.2.3 TTC染色法测定花粉活力 用发丝蘸取少量花粉置于洁净的载玻片上，轻滴1～2滴0.5% TTC溶液，摇匀后盖好盖玻片，置于35 ℃恒温箱中，30分钟后置于光学显微镜下观察。被染成红色的花粉活力强，淡红色的花粉活力较强，无色则没有活力[14]。

1.2.4 数据处理 采用SPSS 22.0软件进行数据处理和统计分析；百分率数据转换为反正弦数据再进行统计分析。根据试验结果求得极差(R)，极差越大，该因素对试验影响程度越大。

2 结果与分析

2.1 不同培养基组分对离体花粉萌发的影响

由表2、3、4可知，对“雄株3号”与“雄株8号”花粉离体萌发率而言，蔗糖浓度的影响最大，硼酸次之，硝酸钙最小；对“鄂柿1号”而言，蔗糖浓度影响最大，硝酸钙次之，硼酸最小。因此，蔗糖浓度是影响供试品种花粉萌发的主要因素；3种柿种质花粉在试验处理8的蔗糖、硼酸、硝酸钙浓度配比条件下花粉离体萌发率均最高，也最利于花粉管生长(图1)。由此得出3种柿种质花粉离体萌发的最佳培养基组成：蔗糖200 g/L，硼酸150 mg/L，硝酸钙100 mg/L。

图1 “鄂柿1号”花粉在试验处理2(A)和处理8(B)的萌发状况

表2 “雄株3号”悬滴培养正交试验统计分析

表3 “雄株8号”悬滴培养正交试验统计分析

表4 “鄂柿1号”悬滴培养正交试验统计分析

2.2 不同染色方法对雄性柿种质花粉活力检测结果的影响

采用I2-KI染色法对“雄株3号”和“雄株8号”花粉进行染色，盖好盖玻片，放置20分钟后，在显微镜下观察，发现有部分花粉变为蓝色，但变色程度不明显，区分度不十分明显(图2)，两种花粉的着色率分别为21.6%和25.8%(见表5)。该方法虽然速度快，但并不能准确地表示花粉活力，也不适合于研究某单一处理对花粉活力的影响。因为三核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘同样呈蓝色。即使花粉没有活力也能被染成蓝色。

表5 不同染色法测定的完全雄株柿种质花粉活力

图2 I2-KI(A)和TTC(B)染色快速检测柿花粉活力比较

采用TTC染色法对“雄株3号”和“雄株8号”花粉进行染色，搅拌均匀后盖上盖玻片放置于35 ℃恒温箱中，30分钟后镜检，观察到部分花粉被染成红色，染色程度也有差别。两种花粉的着色率分别为31.5%和26.0%。该方法相对于淀粉碘化钾染色法更为准确，因为可以排除三核期退化的花粉中的淀粉影响，而且可以根据染色的深浅来判断花粉的活力状况，颜色越深，花粉的活力越强；颜色越浅或局部染色，花粉的活力越弱。但该方法耗时略长。

3 结论与讨论

糖类物质是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质[15]。硝酸钙和硼酸是花粉萌发所需的矿质元素[16]。钙离子的动态变化对花粉萌发启动、花粉管的生长调节具有重要作用[17-18]。本试验结果表明，蔗糖对“雄株3号”“雄株8号”和“鄂柿1号”花粉的萌发影响显著，而且随着蔗糖浓度的升高，花粉离体萌发率也随之升高。统计分析结果发现，3种中国原产雄性柿种质花粉离体萌发最适宜的培养基组合为蔗糖含量为200 g/L，硼酸含量为150 mg/L，硝酸钙含量为100 mg/L，其中蔗糖的含量为决定性因素。

花粉活力可根据花粉所染颜色来快速判定，这种方法的优点在于简单、迅速，但由于受花粉自身的特性影响，结果会出现一定程度的偏差。I2-KI染色法测得“雄株3号”的花粉活力弱于“雄株8号”，但用TTC染色法时，测得的“雄株3号”的花粉活力强于“雄株8号”。不同品种花粉粒内的淀粉含量不同，虽然花粉失去了活力，但由于其花粉粒内的淀粉依然存在，同样会呈现蓝色而使得测定值偏高[19]。I2-KI染色法测定需要时间更短，TTC染色法其次，本试验二者测定出来的花粉活力并无明显差异，均显著低于悬滴法测定的花粉活力，这可能与个体花粉外壁太厚，染色剂未能进入花粉细胞内有关。

3种方法的花粉活力测定速率为I2-KI染色法最快，TTC染色法其次，悬滴培养法最慢。适合“雄株3号”“雄株8号”“鄂柿1号”花粉离体萌发培养基是蔗糖200 g/L+硼酸150 mg/L+硝酸钙100 mg/L。I2-KI染色法和TTC染色法均可用于快速测定柿花粉活力，两种方法测定的花粉活力低于悬滴培养法。I2-KI和TTC染色法可以快速判定花粉的活力，在柿杂交育种中可作为快速初步判定花粉活力的方法，再结合悬滴培养法较为准确地测定花粉活力，为柿遗传改良中花粉活力的检测提供科学依据。