苦豆子种子营养成分及其急性毒性

苏永霞，冯 平，朝克图，苏日拉格，路 浩，吴晨晨，赵宝玉

(1. 西北农林科技大学 动物医学院 中国西部有毒植物研究所，陕西杨凌 712100；2. 榆林学院 生命科学学院，陕西榆林 719000；3. 阿拉善左旗吉兰泰镇综合保障和技术推广中心，内蒙古阿拉善 750300；4. 阿拉善左旗银根苏木综合保障和技术推广中心，内蒙古阿拉善 750300)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)俗名苦豆草、苦豆根、欧苦参、草槐等，是豆科槐属多年生草本植物，主要分布于中国西北干旱半干旱的荒漠化和盐碱化等地区，面积约为180万 hm2，资源储量十分丰富[1-2]。作为传统药源植物，苦豆子具有清热解毒、抗菌消炎和杀虫等作用，在民间常被用来做止痛剂、抗菌剂和抗风湿剂，用于治疗发烧和胃肠疾病[3]。同时，苦豆子地下根茎发达，耐干旱、耐盐碱、抗风固沙，是一种很好的防风固沙植物，在西北干旱荒漠化地区对维护生态平衡和防止土地沙漠化具有重要生态作用[4]。有研究表明，苦豆子主要含有生物碱、黄酮类、挥发油、脂肪酸、甾体类等多种化学成分，其中生物碱是其主要活性成分，含量较高，且药理作用研究最为深入[5]。苦豆子全草生物碱含量约为6.11%～8.03%，种子中最高约为8.11%，具有抑菌抗炎、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等药理活性[6-9]。在医药方面，以苦豆子生物碱为原料开发的克泻灵片、妇炎栓、苦参素注射液和苦参素胶囊等制剂，已广泛用于人医临床，用于急慢性肠炎、妇科炎症以及肝炎等多种疾病的治疗；在农业方面，苦豆子可作为有机绿肥、农药、动物饲料等开发利用[1]。但同时，苦豆子也具有一定的毒性，青绿时期毒性较大、枯萎时毒性较小，在冬春季饲料缺乏时牲畜常因饥饿采食而引起中毒，其中马属动物较为敏感，羊、驴等过量采食严重者也会引起死亡[10]。鉴于苦豆子在中国资源储量丰富，并且具有较高的药用价值和生态功能，因此，人们越来越重视苦豆子的资源保护与开发利用。目前，有关苦豆子资源化利用的研究，主要集中在苦豆子的地上部分，而苦豆子种子营养成分如何，是否有毒性及资源化利用的潜力，研究甚少。本研究拟通过检测苦豆子种子的营养成分及其对小鼠的急性毒性大小，以期为苦豆子种子的毒性毒理研究和资源化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本 苦豆子种子于2019年10月采自内蒙古阿拉善吉兰泰镇(105°45′30.6″E，39°45′22.6″N)，主要采集成熟期苦豆子荚果，置阴凉通风处晾晒，干燥后经脱痂皮处理获得苦豆子种子，保存，备用。

1.1.2 试验动物 昆明系清洁级健康小鼠，雌雄各半，体质量为(20±2)g，购自成都达硕试验动物中心，饲养室温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，试验前适应性饲养7 d。

1.1.3 仪器与试剂 EV311旋转蒸发仪(北京莱伯泰科仪器有限公司)、SHB-Ⅲ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、DLK-5003快速低温冷却循环机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、U-3900H型紫外-可见分光光度计(上海美谱达)、L-8900型氨基酸自动分析仪(华美辰)、Z-2000型原子吸收分光光度计(日立)和KJEI-TECTM8400型凯式定氮仪(上海沛欧)等；主要试剂有二氯甲烷、正丁醇、甲醇、浓硫酸、高氯酸、次硝酸铋等，均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 苦豆子种子营养成分分析 取阴干的苦豆子种子粉碎，100目筛子过筛，随后按国标法进行相关营养成分检测。常规营养成分按GB 14924.3-2010《实验动物 配合饲料营养成分的测定》、矿物质元素按 GB/T 13885-2017《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法》、磷元素按GB 5009.87-2016《食品安全国家标准 食品中磷的测定》、硒元素按GB/T 5009.93-2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》和氨基酸按GB/T 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》进行测定。

1.2.2 苦豆子种子醇浸膏及其生物碱的提取 苦豆子种子阴干粉碎后分装于圆底烧瓶，加入体积分数为95%工业酒精进行热回流，回流温度为72 ℃，时间为4 h，重复上述回流过程4～5次，得到苦豆子醇提液。随后用旋转蒸发仪旋蒸浓缩醇提液，得到醇浸膏。浸膏用1 mol/L HCl溶解，抽滤，除去不溶性残渣，得到酸水液。随后将酸水液置于分液漏斗，按母液∶二氯甲烷=3∶1的体积比用二氯甲烷反复萃取以除去杂质；萃取后剩余的酸水液用少量固体NaOH调节pH至9～11，依次用二氯甲烷和正丁醇反复萃取，减压回收溶剂得到碱性二氯甲烷部分和碱性正丁醇部分，二者合并为苦豆子种子生物碱部分。

1.2.3 急性毒性试验 参照毒理学试验方法与技术以及LD50计算原则，苦豆子种子醇浸膏以 3 000.00 mg/kg、2 400.00 mg/kg、1 920.00 mg/kg、1 536.00 mg/kg、1 228.80 mg/kg、 983.04 mg/kg和786.43 mg/kg为正式试验剂量组，苦豆子种子生物碱以800.00 mg/kg、 567.38 mg/kg、402.39 mg/kg、285.39 mg/kg和202.40 mg/kg为正式试验剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半，逐只称体质量后灌胃染毒，每10 g体质量给药量为0.1 mL。在苦豆子种子醇浸膏和生物碱分别灌胃染毒后的1 h内持续观察小鼠的毒性反应以及死亡情况，包括饮食、排泄物和外观行为等变化。随后每隔1 h观察每组小鼠的毒性反应，并统计24 h内小鼠死亡分布情况。死亡小鼠及时进行解剖，观察脏器有无病理变化，其他小鼠于试验结束观察愈后效果，观察期为14 d。

1.2.4 结果统计及分析 营养成分检测时各项目均做3次独立重复试验，所得数据用SPSS 20.0进行统计分析，所得结果用“平均数±标准差”表示。急性毒性试验，采用改良寇氏法分别计算小鼠单次灌胃染毒后苦豆子种子醇浸膏和生物碱的LD50和95%可信限。

2 结果与分析

2.1 苦豆子种子营养成分测定

2.1.1 常规营养成分 由表1可知，苦豆子种子中干物质的含量最高，粗灰分的含量最低。

2.1.2 矿物质元素 如表2所示，苦豆子种子常量元素有Ca、P，K和Mg，其中K含量最高为 7 002.25 mg/kg，Ca和P含量相当，二者的比值为1.1，Mg含量相对较低，为1 416.00 mg/kg。表明苦豆子种子常量元素较丰富，可以作为动物饲料矿物质的来源。微量元素测定结果显示，苦豆子种子中含有Fe、Mn、Zn、Cu、Cr和Se。研究显示，当Zn/Cu>10及Zn/Fe>1，这些矿物质元素的生物学功能就会发生拮抗作用。苦豆子种子中 Zn/Cu值为4.82，Zn/Fe值为0.25，这2个比值均在合理范围之内，有利于动物机体的吸收，可以作为动物补充无机矿质元素的饲料来源。Mn、Cr、Se等对机体的糖代谢和蛋白质代谢具有重要作用，苦豆子种子中Mn元素的含量较高，Cr、Se的含量相对较低，但其含量都符合饲料中的允许量，对动物机体具有重要的作用。

表2 苦豆子种子的矿物质元素含量Table 2 Contents of mineral elements in seeds of S.alopecuroides

2.1.3 氨基酸 如表3所示，苦豆子种子中共有17种氨基酸，总含量为17.673%，其中必需氨基酸(EAA)9种，含量为5.780%，占总氨基酸(TAA)的32.705%。非必需氨基酸(NEAA)8种，含量为11.893%，占总氨基酸(TAA)的 67.295%。药效氨基酸9种，含量为11.704%，占总氨基酸的66.3%。9种必需氨基酸的含量依次为Leu>Lys>Val> Phe>Tyr>Thr>Ile>Met>Cys，8种非必需氨基酸含量依次为Glu>Arg>Pro>Asp>Gly>Ger>Gla>His，9种药效氨基酸含量依次是Glu> Arg>Asp>Leu>Lys>Gly>Phe>Ile>Met。其中，所有氨基酸中EAA/NEAA=0.49，EAA/TAA=0.33，均接近并低于WHO/FAO提出的理想蛋白质EAA/NEAA=0.60和EAA/TAA=0.40的要求，可见苦豆子种子的氨基酸种类和含量比较丰富，配比较为合理，具有较高的营养价值。

表3 苦豆子种子的氨基酸含量Table 3 Contents of amino acid in seeds of S.alopecuroides

本试验采用FAO/WHO提出的氨基酸比值系数法对苦豆子种子的氨基酸进行评价[11]。由表4可知，苦豆子种子中蛋氨酸+半胱氨酸值远低于FAO/WHO推荐的氨基酸模式谱标准，并且其RC值最小为0.25，RC最小者为第一限制性氨基酸，所以蛋氨酸和半胱氨酸为苦豆子种子的第一限制氨基酸。SRC值越接近100，EAAI值接近1，则植物蛋白营养价值越高[11]，本试验中苦豆子种子的SRC、EAAI分别为59.04和 0.85，所以苦豆子种子可作为理想的植物蛋白来源。

表4 苦豆子种子的氨基酸含量和营养评价Table 4 Amino acid content and nutrition evaluation in seeds of S.alopecuroides

2.2 急性毒性试验

2.2.1 苦豆子种子醇浸膏 小鼠灌胃染毒后， 3 000.00mg/kg、2400.00mg/kg和1920.00 mg/kg剂量组小鼠在染毒后表现为短暂性安静，大约在染毒10 min左右，小鼠出现明显的呼吸系统症状和神经系统症状。主要表现为呼吸频率加快以及全身震颤、运动失调、四肢呈划水状无法站立，有时还会出现上下跳跃、惊恐不安等情况。神经症状明显的小鼠在1 h内都表现为强直性痉挛后死亡，死亡小鼠解剖可见其脏器器官无明显的病理损伤，存活小鼠在神经症状过后表现为身体蜷缩、精神沉郁，24 h后存活小鼠饮食和精神状况逐渐恢复正常。1 536.00 mg/kg和1 228.80 mg/kg剂量组小鼠，神经症状较前3个剂量组轻，小鼠死亡数也减少。983.04 mg/kg和 786.43 mg/kg剂量组小鼠，染毒后个别小鼠表现为身体蜷缩发抖、精神沉郁，大部分小鼠精神状态良好。染毒后各组小鼠的急性毒性死亡情况如表5所示，各组小鼠在24 h内存活情况如图1所示。采用改良寇氏法计算小鼠单次灌胃苦豆子种子醇浸膏的LD50为1 406.05 mg/kg，95%可信限为 1 221.80～1 621.81 mg/kg。

表5 苦豆子种子醇浸膏对小鼠的急性毒性试验结果Table 5 Acute toxicity result of extract from S.alopecuroides seeds to mice

2.2.2 苦豆子种子生物碱 小鼠灌胃染毒后，800.00 mg/kg和567.38 mg/kg剂量组小鼠在染毒后10～20 min左右出现明显的临床症状，外观行为以及死亡情况与灌胃高剂量苦豆子种子醇浸膏后的表现相似。其他3组低剂量组小鼠，给药后表现为焦躁不安与精神沉郁、安静交替出现，极少部分小鼠表现为上下跳跃等神经症状，大部分小鼠在神经症状过后能正常饮食、运动，愈后效果良好。给药后各组小鼠的急性毒性死亡情况如表6所示，各组小鼠在24 h内存活情况如图2所示。采用改良寇氏法计算小鼠单次灌胃苦豆子种子生物碱的LD50为416.87 mg/kg，95%的可信限为346.74～501.19 mg/kg。

表6 苦豆子种子生物碱对小鼠的急性毒性试验结果Table 6 Acute toxicity result of alkaloids from S.alopecuroides seeds to mice

3 讨 论

苦豆子全草中苦豆子种子的产量极高，但是目前对于苦豆子种子的资源化利用研究报道较少。本研究结果显示，苦豆子种子中粗蛋白含量为25.19%、粗脂肪为4.46%、粗纤维为 20.22%，紫花苜蓿素有“牧草之王”的美称，其粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的含量分别为26.1%、 4.5%和17.2%，通过与其比较，苦豆子种子粗蛋白、粗脂肪的含量与紫花苜蓿相当，粗纤维的含量比紫花苜蓿稍高；与矮象草、黑麦草和草木樨等牧草相比，苦豆子粗蛋白的含量比这些牧草高很多，粗纤维的含量比这些牧草低[12]。而牧草的营养价值在很大程度上取决于其粗蛋白和粗纤维的含量，饲料中的粗蛋白可为动物提供营养，粗纤维有助于减少动物瘤胃臌气，促进动物消化，苦豆子种子中粗蛋白含量较高、粗纤维含量适中，所以苦豆子作为饲料具有很大的利用潜力。此外，研究表明[13]苦豆子提取生物碱后剩余的籽渣和草渣中含有较高的蛋白质和微量的生物碱，用其废渣饲喂羊只，不仅具有抑制肠道有害细菌的作用，还能促进饲料的消化吸收，加快羊只生长，有助于干旱地区畜牧业的发展。

矿物质元素对动物机体具有重要的作用，其含量过多或缺乏都会对动物机体的生长发育造成影响。苦豆子种子中含有Ca、P、K、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Cr和Se等多种矿物质元素，其中Ca含量为2 587.50 mg/kg，P为2 353.50 mg/kg，Ca、P比值为1.1，研究显示羊饲粮中Ca、P比例在 1～2∶1较为适宜，Ca含量过高或过低都会影响其他矿物质元素的吸收，而Fe与血红蛋白的合成和多种酶的活性有关[14-15]。有文献报道[14]，饲料中Cu含量缺乏会引起羔羊蹒跚，含量过多还会引起流涎、腹泻等中毒症状，Zn元素对公羊睾丸中精子的形成和羊毛的生长具有重要作用，苦豆子种子中Fe、Cu、Zn的含量都符合美国 NRC推荐的绵羊饲粮中矿物质的需求量，并且苦豆子种子的Zn/Cu值为4.82，Zn/Fe值为0.25，这两者的比值都较为合理，在动物利用过程中不会发生拮抗作用。苦豆子种子中还含有微量的Cr、Se，这两种元素对增强动物免疫力和抗氧化具有重要的作用。

本研究中，苦豆子种子含有17种氨基酸，总氨基酸含量为17.673%，与紫花苜蓿总氨基酸含量14.85%～19.48%相当，说明其具有较高的营养价值[16]。苦豆子种子的必需氨基酸中，蛋氨酸+胱氨酸低于标准模式谱较多，是苦豆子种子的第一限制氨基酸，其他各种必需氨基酸较接近或高于模式谱标准值，表明苦豆子种子的氨基酸相对均衡合理。此外，苦豆子种子的药效氨基酸种类丰富，含量为66.2%，说明苦豆子种子可能还具有一定的药用价值，其氨基酸含量较高的主要有Glu、Arg、Pro和Asp，Glu具有促进红细胞生成、改善脑细胞营养及活跃思维作用，Asp酸有治疗肝脏和胆汁分泌障碍的功能，Arg可有效提高免疫力等作用[17]。

急性毒性试验结果显示，苦豆子种子醇浸膏的LD50为1 406.05 mg/kg，95%可信限为 1 221.80～1 621.81 mg/kg，苦豆子种子生物碱的LD50为416.87 mg/kg，95%的可信限为 346.74～501.19 mg/kg。苦豆子种子醇浸膏和生物碱分别灌胃染毒后，小鼠都会出现明显的神经兴奋和呼吸系统症状，且高剂量组出现神经症状的大部分小鼠都会表现出强直性痉挛后死亡，低剂量组小鼠在神经症状过后，能正常饮食和运动，愈后效果良好，说明试验过后苦豆子对小鼠的持续性影响较小。本试验中小鼠的神经症状和呼吸系统症状明显，说明苦豆子对小鼠的毒作用靶器官可能是脑和肺脏，余建强等[18]研究表明，槐定碱对中枢神经系统具有明显的兴奋作用，曹晓东等[19]研究显示，小鼠经口摄入苦豆子总碱后，主要损伤的器官是肺脏和脑，从而引起这些器官的机能代谢障碍，这与本试验结果一致。有资料记载[20]苦豆子槐果碱主要作用于神经系统和心血管系统，低剂量时对神经系统有抑制作用，高剂量时则表现为兴奋，而在本试验中苦豆子浸膏和生物碱的低剂量组小鼠主要表现为精神沉郁，高剂量组小鼠主要表现为全身震颤、上下跳跃以及精神亢奋等神经症状，可能与苦豆子总碱中含有槐果碱有关。此外，苦豆子种子醇浸膏和生物碱分别染毒后，小鼠的临床症状表现相似，说明苦豆子中的主要毒性成分为生物碱，因此苦豆子在提取生物碱后可以安全利用。根据 WHO口服外源毒物分级标准[9]，本试验测得苦豆子种子浸膏的LD50为1 406.05 mg/kg，具有低等毒性，苦豆子生物碱的LD50为416.87 mg/kg，具有中等毒性。

以上结果表明，苦豆子种子中含有较高的粗蛋白和粗纤维，并且富含多种矿物质元素和氨基酸，配比较为合理，可以作为家畜的蛋白质补充饲料。但通过急性毒性试验，发现其种子中含有的生物碱具有中等毒性，家畜直接采食会产生毒害作用，因此苦豆子需脱毒处理后才能作为动物蛋白质的补充饲料。