芦笋液体发酵灵芝工艺及其对多糖质量浓度的影响

董玉玮，沙爽，张浩赟，周立辉，陈学红，曹修春

1.徐州工程学院食品与生物工程学院（徐州 221018）；2.徐州山崎农产品技术研发有限公司（徐州 221700）

芦笋（学名：Asparagus officinalisL.）为石刁柏的幼苗，为百合科天门冬属。芦笋含有丰富的氨基酸、膳食纤维和矿物质元素，皂苷、多糖、黄酮类[1]等活性物质；具有抗癌[2-3]、抗衰老[4]、抗紫外线[5]、预防心脑血管疾病[6]。灵芝为多孔菌科真菌，其有效成分是三萜类、多糖，具有很强的抗氧化性和清除自由基能力[7]，被古今中外医药学家视为滋补养生、强身壮体的珍品[8-9]。

芦笋的市场需求量及交易量逐年增加，高品质芦笋主要用于出口，而低品质的芦笋利用率较低，其主要原因是纤维素和木质素在低品质和长期贮藏的芦笋中含量高，口感差。将这部分芦笋进一步开发利用将有利于提升其利用价值。灵芝等药食真菌菌丝体能利用纤维素、木质素为碳源，产生多糖、三萜类等活性物质。因此如果以低品质芦笋为原料，采用液体深层发酵技术，制备发酵型药食真菌，将具有生产成本小、产量较大、操作方便快捷、生产效率显著提高等优势[10]。相比于传统的化学试剂，液体发酵更符合绿色环保的理念，在产品质量和操作可控制性方面有明显优势[11]。李弈等[12]研究发现，液体发酵生产药用真菌代用品可有效解决天然药用真菌资源逐渐枯竭和生态环境保护的难题，是一种天然健康的发酵工艺。

以低品质芦笋为培养基，液体发酵灵芝，根据多糖质量浓度优化其发酵工艺，并对发酵液中的理化成分进行的测定，为芦笋、药食真菌精深加工产业发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂和仪器

1.1.1 试验材料和试剂

灵芝菌种（实验室保存高活性灵芝菌种）；芦笋（品质低于出口标准，徐州山崎农产品技术研发有限公司）；乙醇、浓硫酸、苯酚、磷酸二氢钾、硫酸镁等（均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 试验仪器和设备

DHP-9032电热恒温培养箱（上海一恒仪器有限公司）；HH-2电热恒温水浴锅（邦西仪器科技（上海）有限公司）；XFH-50CA手提式压力蒸汽灭菌锅（浙江新丰医疗器材有限公司）；HYG-II回旋式恒温调速摇瓶柜（上海欣蕊自动化设备有限公司）；TDL-5A低速大容量离心机（上海圣科仪器设备有限公司）；JA1003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；1260液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪（美国Thermo公司）。

1.2 培养基的配制

1.2.1 PDA培养基

PDA培养基：200 g土豆，洗净去皮切碎，加1 000 mL水，煮25 min，滤渣取液体，向其中加磷酸二氢钾3 g，琼脂粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏3 g，硫酸镁1.5 g和微量VB1，加热搅拌，溶解后，加水补充到1 000 mL，装于三角瓶内，高压灭菌40 min，取出备用。

1.2.2 液体发酵培养基

芦笋液体培养基：芦笋粉碎后，按0.25%～1.25%装入三角瓶，加入1%酵母膏，2%可溶性淀粉，100 mL水配成液体发酵培养基。高压灭菌后，取出冷却至室温。

1.3 灵芝菌种的活化和培养

将灵芝菌种在无菌操作台内接入PDA斜面培养基中，于28 ℃培养箱培养5～6 d。挑选长势好的菌种，接种在液体培养基中，于28 ℃摇床培养6～8 d。

1.4 单因素试验

以芦笋添加量、温度、装液量3个因素为考察对象，每组试验重复3次。

1.4.1 芦笋添加量

分别向三角瓶中加入0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 g粉碎后的芦笋，加入100 mL液体培养基，高压灭菌后接种，于28 ℃摇床培养5～7 d。

1.4.2 温度

分别向装有100 mL液体培养基的三角瓶中加入0.75 g粉碎后的芦笋，高压灭菌后接种，分别放入温度为24，26，28，30和32 ℃的摇床，培养5～7 d。

1.4.3 装液量

依次向三角瓶中加入0.75 g粉碎后的芦笋，分别加入60，80，100，120和140 mL的液体培养基，高压灭菌后接种，于28 ℃摇床培养5～7 d。

1.5 正交试验设计

选取温度、芦笋质量分数、装液量3个因素，每个因素选取3个水平。试验因素与水平如表1所示。

表1 试验的因素与水平

1.6 多糖的提取及测定

1.6.1 粗多糖的提取方法

将培养后的发酵液以4 000 r/min离心10 min，取上清置于50 ℃烘箱中烘至原体积1/5，加入5倍体积95%乙醇，在4 ℃冰箱中过夜醇沉后，以4 000 r/min离心5 min，取沉淀于50 ℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.6.2 多糖质量浓度的测定——苯酚硫酸法

将1 g粗多糖加入100 mL蒸馏水充分溶解，取2 mL多糖溶液，加1 mL 6%苯酚、5 mL浓硫酸，混匀，100℃水浴15 min，冷却至室温，在490 nm处测定样品吸光度，对照组为蒸馏水。通过葡萄糖标准曲线计算多糖质量浓度。

1.6.3 粗多糖的纯化

Sevag法脱蛋白：将1 g粗多糖加入10 mL纯水溶解，加入2.5 mL Sevag试剂（V（氯仿）∶V（正丁醇）=5∶1），将混合溶液装入分液漏斗中振荡18～20 min，取上层溶液以4 000 r/min离心15 min，弃下层液体，上清液重复上述操作，至无蛋白质层，合并上清液备用。

取截流相对分子质量6 000～8 000的半透膜袋，沸水水浴5 min，用纯水将其冲开，封住一端，将得到的上清液倒入后封住开口的另一端，置于装有纯水的烧杯中，用磁力搅拌器进行透析，每2 h换1次水，2 d后得到样品烘干即为精制多糖。

1.6.4 葡萄糖标准曲线的制作

取50 mg葡萄糖标准品溶解，制成1 mg/mL葡萄糖标准溶液。取5 mL葡萄糖标准溶液稀释10倍，取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL标准液分别装于试管中，加蒸馏水至2.0 mL，另取一支试管加2 mL蒸馏水，分别加入6%苯酚和5 mL浓硫酸，摇匀静置5 min后，于100 ℃水浴15 min，冷却至室温，在490 nm处测吸光度。标准曲线回归方程为Y=9.092 9X+0.013 6，R2=0.994 8。

1.7 氨基酸组分检测

HPLC检测氨基酸参考邓代信等[13]的方法。

1.8 高效液相色谱检测

多糖中加入0.5 mL 2 mol/L三氯乙酸溶液，于120℃ 水解100 min，用氮吹仪吹干，得样品。

取5 μL单糖标准品加入试管中，加入0.5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，与上述多糖样品一同放置在120 ℃水浴下水解100 min，空气泵吹干。

处理好的单糖样品加入0.5 mL 0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）试剂，0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液。充分混匀后，于70 ℃水浴30 min，冷却至室温，加入0.5 mL氯仿和0.5 mL 0.3 mol/L HCl，充分振荡萃取，以5 000 r/min离心5 min，除去氯仿层后重复2次萃取。用0.22 μm滤膜过滤水层，待测定。

仪器条件：波长245 nm，流动相为0.1 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量10 μL。

1.9 矿物质元素检测

Mg、Fe、Se、Ca、Zn等元素质量分数采用电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）法测定[14]。取适量样品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。静置，反应结束后，盖盖密封，放入微波消解仪，温度冷却到50 ℃以下，取出消解罐放入通风橱中，打开消解罐，用超纯水润洗，转移至50 mL容量瓶中，润洗3～4次，用超纯水稀释、定容至刻度，待测。空白对照同法处理。ICP-MS仪器参数：射频功率1 550 W，泵速40 r/min，雾化室温度2.7 ℃，采样深度5 mm，冷却气流速14 L/min，辅助气流速0.8 L/min，雾化气流速1.122 L/min。

1.10 数据分析

采用Origin 9.0软件处理数据并作图，所有数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 芦笋质量分数对多糖质量浓度的影响

如图1所示，芦笋质量分数0.25%～1.25%时，随着芦笋质量分数增加，多糖质量浓度先增加后减少，芦笋质量分数0.75%时，多糖质量浓度达到最大值2.33 mg/mL。辛燕花等[15]研究何首乌发酵灵芝工艺时也有类似结果，发现何首乌含量0.7%～0.8%时，多糖质量浓度最高。

图1 芦笋质量分数对发酵液中多糖质量浓度的影响

2.1.2 装液量对多糖质量浓度的影响

如图2所示，锥形瓶装液量60～100 mL时，多糖质量浓度随着装液量增加，先增加后减少，装液量100 mL时，多糖质量浓度达到最大值2.24 mg/mL。田淑雨等[16]通过单因素试验研究灵芝多糖提取得率时，发现装液量90～100 mL时，所获得的多糖量最高，与试验结果基本一致。

图2 装液量对发酵液中多糖质量浓度的影响

2.1.3 温度对多糖质量浓度的影响

如图3所示，温度范围24～28 ℃时，随着温度增大，多糖质量浓度先增加后减少，温度28 ℃时，多糖质量浓度达到最大值2.51 mg/mL。冯嫣等[17]研究灵芝孢子粉提取多糖工艺时，发现温度28 ℃时，所得到的多糖质量浓度为2.6 mg/mL，与试验结果基本一致。

图3 温度对发酵液中多糖质量浓度的影响

2.2 正交试验

正交试验设计方案，通过具体试验得到多糖质量浓度，如表2所示。

表2 设计方案和结果

从表2结果可以看出，极差项R大小为A＞C＞B，即温度的影响因素最大，其次是装液量，最后是芦笋质量分数。综合3种因素对液体发酵灵芝多糖影响可知，发酵工艺最优组合为A2B2C2，即液体发酵温度28 ℃、芦笋质量分数0.75%、装液量100 mL时所得发酵液中多糖质量浓度最高。以A2B2C2为优化条件设计正交试验验证试验，最终得到多糖质量浓度为2.73 mg/mL。

2.3 多糖中单糖组分检测

每种单糖标准曲线方程为：葡萄糖y=62.22x+270.7，R2=0.999 09；甘露糖y=82.26x+86.27，R2=0.999 94；阿拉伯糖y=71.82x+277.47，R2=0.999 26；半乳糖y=78.79x+207.08，R2=0.999 71；木糖y=57.01x+302.88，R2=0.998 53；半乳糖醛酸y=87.49x-60.39，R2=0.999 96；葡萄糖醛酸y=86.51x-61.36，R2=0.999 98。芦笋-灵芝多糖中所含单糖组分色谱图见图4，质量分数见图5。

图4 多糖中单糖组分的高效液相色谱图

图5 多糖中单糖组分质量分数

从检测结果中可以看出，多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成，其中葡萄糖质量分数最高，为282 591.33 mg/kg。隋晓辰等[18]通过对深层发酵灵芝胞内多糖结构分析得出，胞内多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖等5种成分组成，其种葡萄糖、半乳糖、甘露糖摩尔比83.75∶4.76∶4.15，其中葡萄糖量最大；黄静涵等[19]分离纯化灵芝多糖，得出灵芝单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木聚糖，物质的量比率为4∶2∶10∶1，葡萄糖物质的量最高，均与试验结果基本一致。

芦笋-灵芝发酵液经高效液相色谱测定含有多种氨基酸，见图6。

图6 氨基酸组分的高效液相色谱图

氨基酸与矿物质元素质量分数见图7。从图7可以看出，发酵液中含有赖氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等多种氨基酸，其中脯氨酸质量分数最高，为3.9 g/kg。铁、锌、镁、硒、钙等矿物质元素中钙质量分数最高，达68.6 g/kg，硒为0.03 mg/kg。隋月红等[20]研究发现，嫁接红枣中钙质量分数最高达0.76 g/kg，硒为0.005 9 mg/kg，均低于发酵液中钙和硒质量分数。

图7 芦笋-灵芝液体发酵液中理化指标测定结果

发酵液还中含有7种人类必需的氨基酸，营养价值较高。脯氨酸质量分数最高，能够帮助分解蛋白质，是理想的渗透调节物质。亮氨酸、异亮氨酸等部分苦味氨基酸，有利于蛋白质向氨基酸转化、形成和积累。呈鲜味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸占比19%，9种药效氨基酸占比52%，必需氨基酸与氨基酸总量比值29%，必需氨基酸与非必需氨基酸比值40%。说明制备的芦笋-灵芝口感鲜美，营养物质丰富，具有很高的药效价值。黄清铧等[21]研究发现，灵芝发酵甘蔗汁中呈鲜味氨基酸占比32%，必需氨基酸与氨基酸总量比值34%，必需氨基酸与非必需氨基酸比值51%，与发酵液研究结果相似。

3 结论

1) 单因素试验表明，培养基中芦笋质量分数0.50%～1.00%、装液量80～120 mL、培养温度26～30 ℃时，能获得较高多糖质量浓度。

2) 正交试验优化得出最佳方案：芦笋质量分数占总装液量的0.75%，装液量100 mL，温度28 ℃，此时得到的多糖质量浓度最高，为2.64 mg/mL。

3) 发酵液多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等单糖组成，其中葡萄糖质量分数最高，为282.59 g/kg；氨基酸中脯氨酸质量分数最高，达3.9 g/kg，矿物质元素钙、硒质量分数分别达68.6 g/kg和0.005 9 mg/kg。