一种藻蓝蛋白衍生物的制备及稳定性

郑守晶，杨梦琴，郑明锋

1.福建农林大学金山学院（福州 350002）；2.福建农林大学食品科学学院（福州 350002）

藻蓝蛋白（phycocyanin，PC），其荧光发射峰为615～640 nm[1-2]，是一种天然无毒的色素蛋白复合体，也是我国GB 2760—2014《食品添加剂使用卫生标准》中规定的仅有的两种天然蓝色素之一[3]，其生理功能丰富[4]，被广泛应用于食品和化妆品中[5]。藻蓝蛋白通过硫链键结合四吡咯化合物、脱辅蛋白和α、β两个亚基[6]。1个四吡咯环辅基以共价键形式结合在肽链上[7]。三聚体和六聚体是藻蓝蛋白亚基的主要存在形式，少数有二聚体或聚集度更高的聚集体。藻蓝蛋白的存在形式受到离子强度、蛋白质浓度、pH、辐射、光照强度和光照时间等因素的影响[8]。藻蓝蛋白中的四吡咯类色素与叶绿素、血红素中的四吡咯类色素的主要结构区别在于：叶绿素卟啉环中含有一个镁原子，血红素卟啉环中含有一个铁原子，而藻蓝蛋白卟啉环中有一个镍原子[9]。

目前关于藻蓝蛋白衍生物的研究较少，以钙离子替代卟啉环中心原子镍，获得藻蓝蛋白衍生物，并研究其稳定性，使其功效进一步扩大，既可以作为食品添加剂应用于食品中，还能作为功能性成分应用于生物医药方面，具有极大的开发潜力。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

藻蓝蛋白（西安泽邦生物科技有限公司）；CaCO3、HCl、NaOH 、H2O2等均为分析纯。

1.2 试验仪器与设备

UV-5500紫外-可见分光光度计（上海亚研电子公司）；W201恒温水浴锅（上海贤德实验仪器公司）；L550台式离心机（上海贤德实验仪器公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 藻蓝蛋白衍生物制备

配制100 mL 1%藻蓝蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，于50 ℃水浴浸提1.0 h，离心（3 000 r/min）10 min取上清液，测定其在300～700 nm范围内的吸光度，绘制光谱扫描曲线。

1.3.2 藻蓝蛋白衍生物的提取单因素试验

在制备藻蓝蛋白衍生物的过程中发现，浸提液中很少含有最大吸收峰区的干扰物质，因此试验采用吸光度A579的大小来衡量衍生物中色素含量的多少。

1) 温度：配制100 mL 1%藻蓝蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，分别在不同温度（30，40，50，60和70 ℃）条件下水浴浸提1.0 h，然后3 000 r/min离心10 min，取蓝色上清液[10]，再分别测定藻蓝蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

2) 提取时间：配制100 mL 1%藻蓝蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，于50 ℃水浴，分别浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，然后3 000 r/min离心10 min，取蓝色上清液，再分别测定藻蓝蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

3) 料液比：CaCO3以1∶80，1∶90，1∶100，1∶110和1∶120（g/mL）的料液比在50 ℃水浴浸提2.5 h，然后3 000 r/min离心10 min，取蓝色上清液，再分别测定藻蓝蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

1.3.3 藻蓝蛋白衍生物单因素正交试验

根据单因素试验结果，以反应温度（A）、反应时间（B）和料液比（C）为因素，以吸光度A579为指标，设计正交试验，因素水平表见表1。

表1 藻蓝蛋白衍生物提取试验因素水平表

1.3.4 藻蓝蛋白衍生物稳定性影响

采用最佳提取工艺制备衍生物提取液，并避光冷藏于4 ℃条件下备用，参考张岩等[11]、曹竑等[12]的方法，考察温度（40，50，60和70 ℃）、光照（室内自然光下储藏1，2，3和4 d）、pH（NaOH调节pH为4～10）、氧化剂（H2O2浓度分别为1%，2%，3%，4%和5%）以及常用食品添加剂（分别添加1%，2%，3%，4%和5%的葡萄糖、蔗糖和柠檬酸）这些因素对衍生物提取液稳定性的影响。

2 结果与分析

2.1 藻蓝蛋白及衍生物的紫外-可见光吸收光谱

在300～700 nm波长范围内，分别用紫外-可见分光光度计对藻蓝蛋白水溶液和衍生物溶液进行扫描，结果分别如图1（a）和图1（b）所示。由图1（a）可知，藻蓝蛋白水溶液光谱最大吸收峰为620 nm左右，与李建宏等[13]的研究一致；而图1（b），其可见光范围内最大吸收峰在579 nm。对比图1（a）和图1（b）可知，最大吸收峰产生了位移。藻蓝素发色基团是影响藻蓝蛋白的吸收光谱主要因素，藻蓝蛋白衍生物在波长579 nm处出现新的吸收峰，说明藻蓝蛋白发色基团的光谱学特性发生改变，可推断产生了与天然藻蓝蛋白不同的衍生物质[14]。

图1 藻蓝蛋白溶液及衍生物溶液光谱扫描曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 反应温度对藻蓝蛋白衍生物的影响

由图2（a）可知，藻蓝蛋白衍生物溶液的吸光度，随着温度的升高，先增加后降低；当反应温度为50 ℃时，溶液的吸光度最高。可能是因为当温度超过藻蓝蛋白稳定温度后，由于蛋白质的热变性作用导致其空间构象的改变，从而改变发色基团的结构[15]，导致吸光度的下降，因此反应温度选择50 ℃。

由图2（b）可知，当反应时间小于2.5 h时，衍生物溶液的吸光度变化不明显，可能是反应不够充分。当反应时间达到3.0 h时，吸光度最高；之后又呈现出下降趋势，因此反应时间确定为3.0 h。

由图2（c）可知，当料液比为1∶100（g/mL），藻蓝蛋白与CaCO3充分接触反应，吸光度最大。料液比继续增加，吸光度减小，所以料液比选择1∶100（g/mL）。

图2 单因素对藻蓝蛋白衍生物吸光度的影响

2.3 藻蓝蛋白衍生物正交试验结果

结合单因素试验结果，安排L9(34)正交试验，对试验数据进行极差分析和方差分析，结果见表2和表3。

表2 正交试验设计及结果

表3 正交设计方差分析结果

由表2可知，影响衍生物溶液吸光度的主次因素为反应温度＞料液比＞反应时间，其最优组合为A2B3C1，即反应温度为50 ℃、反应时间为3.0 h、料液比为1∶80（g/mL）。由表3可知，可知反应温度对吸光度有显著影响，反应时间和料液比对吸光度无显著影响，与极差分析结果一致。对该反应条件进行验证，测得其吸光度为0.330，略优于正交试验中的组合。

2.4 各因素对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

2.4.1 温度对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

温度会对蛋白质的热稳定性产生影响。由图3可知，当温度为40 ℃时，随着加热时间的延长，藻蓝蛋白衍生物的吸光度基本保持不变。当温度升高到60 ℃时，衍生物的热稳定性降低，故吸光度呈明显下降趋势。另外在试验中发现，当温度达到70 ℃时，只需加热0.5 h，溶液就变为淡紫色。因此，衍生物溶液储存温度不高于40 ℃，热稳定性较好。

图3 温度对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

2.4.2 光照对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

由图4可知，藻蓝蛋白衍生物溶液光照4 d，在黑暗条件下吸光度基本保持稳定；在自然光照射条件下，藻蓝蛋白衍生物吸光度变化较大，说明光照对藻蓝蛋白衍生物有一定的影响，在使用时应避光保存。

图4 光照对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

2.4.3 pH对藻蓝蛋白衍生物的影响

pH会对蛋白质的解离程度及所带电荷性质产生影响。由表4可知，藻蓝蛋白衍生物吸光度随着pH增加，溶液颜色由深变浅至无色。pH在5～7范围内，颜色稳定，吸光度变化较小；pH在8～10范围内吸光度减小，溶液褪色；pH为7时吸光度最大，故储存条件应为近中性，其稳定性最好。

表4 pH对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

2.4.4 氧化剂对藻蓝蛋白衍生物的影响

由图5可知，随着氧化剂H2O2浓度的增大，吸光度呈下降趋势，且藻蓝蛋白衍生物溶液颜色由蓝紫色褪色成无色，说明藻蓝蛋白衍生物对抗氧化性较差，在使用时应尽量避免与氧化性物质接触。

图5 H2O2对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

2.4.5 常用添加剂对藻蓝蛋白衍生物的影响

葡萄糖、蔗糖、柠檬酸是食品加工中常用的添加剂。由图6可以看出，随着葡萄糖和蔗糖浓度的增加，衍生物的吸光度得到提高，这可能是因为葡萄糖、蔗糖的加入起到了护色效果[16]。蔗糖虽然也能起到护色效果，但不如葡萄糖显著。随着柠檬酸浓度的增加，衍生物产生沉淀，导致吸光度降低。因此在使用过程中，应避免和柠檬酸同用。

图6 食品添加剂对藻蓝蛋白衍生物稳定性的影响

3 结论

以藻蓝蛋白为原料，制备其衍生物，并进行衍生物稳定性研究。结果表明：碳酸钙与藻蓝蛋白反应后的藻蓝蛋白衍生物溶液呈蓝紫色，在可见光范围内最大吸收波长为579 nm。衍生物最佳的反应条件是反应温度50 ℃、反应时间3.0 h、料液比1∶100（g/mL）。该衍生物储存温度应不高于40 ℃，在近中性、避光条件保存。在食品加工中，葡萄糖和蔗糖可对其产生增色效果，应尽量避免与氧化性物质、柠檬酸共同使用。

对藻蓝蛋白衍生物的制备进行了初步研究，后续可对衍生物中藻蓝素的提取等方面开展进一步研究，为其应用提供更多参考价值。