响应面优化酶法制备高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽参数

蔡晓，戴凌燕，姜鹏，阮长青, ，张东杰, ，李志江, *

1.黑龙江八一农垦大学食品学院（大庆 163319）；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院（大庆 163319）；3.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心（大庆 163319）；4.国家杂粮工程技术研究中心（大庆 163319）

二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制肽是一类具有促进胰岛素分泌功能的生物活性肽，通过抑制DPP-IV对胰高血糖素样肽-1和抑胃肽（GIP）在内的葡萄糖抑制多肽的降解，提高胰岛素的分泌量[1]，被广泛应用于Ⅱ型糖尿病的治疗中。糖尿病是由代谢紊乱引起的慢性疾病[2]，表现为血糖水平过高，易引发中风、心肌梗死等问题，严重时会危及生命[3]。据国际糖尿病联合会统计，在2017年底，糖尿病患者达到4.25亿[4]，其中Ⅱ型糖尿病占95%以上[5]。目前，人工合成的DPP-IV抑制剂已推广应用，如维达列汀、西格列汀等，但在降低血糖的同时也引发了腹泻、过敏等副作用[6]。因此，开发天然、安全的DPP-IV抑制肽引起了重视，成为研究的热点。

高粱是世界五大种植作物之一[7]。高粱具有产量高、耐贫瘠等优势，使其在全世界均有大量的种植。高粱的蛋白质含量为6%～18%，由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白组成[8]，醇溶蛋白占60%～80%[9]，含有大量疏水性氨基酸。有研究表明DPP-IV抑制肽通常具有高比例的疏水性氨基酸，疏水性氨基酸可能会加强与DPP-IV活性位点的相互作用[10]。因此，从高粱醇溶蛋白水解物中获得DPP-IV抑制肽，成为开发糖尿病药物的新方向。

由于高粱醇溶蛋白的消化性较差，近年来对高粱醇溶蛋白的研究主要以生物膜制备[11]及包埋荷载能力[12-13]为方向，制备生物活性肽的相关研究较少，其中制备抗氧化活性肽的研究较为活跃[14-15]，但制备DPP-IV抑制肽的相关研究尚无报道。研究利用木瓜蛋白酶，优化制备高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的最佳工艺参数，为高粱醇溶蛋白的开发与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料和试剂

高粱，龙米粮1号（蛋白质含量9.2%），黑龙江省农业科学院作物育种研究所王黎明研究员馈赠；木瓜蛋白酶（酶活800 U/mg）、碱性蛋白酶（酶活200 U/mg）、风味蛋白酶（酶活30 U/mg）、牛血清白蛋白，索莱宝科技有限公司；中性蛋白酶（酶活100 U/mg），源叶生物科技有限公司；二肽基肽酶IV、甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐，Sigma公司；Folin-酚试剂，北京鼎国生物科技有限公司；乙醇、石油醚等有机溶剂，分析纯，沈阳试剂厂。

1.1.2 仪器与设备

Varioskan Flash酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；CHRISTALpha型冷冻干燥机，CHRIST公司；PHS.2C型精密pH计，美国METTLER TOLEDO公司；Cary60分光光度计，美国安捷伦公司；AB204-N型分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；SENCO恒温水浴锅，上海申生科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 高粱醇溶蛋白的制备

取粉碎后的高粱，按1∶5的比例加石油醚进行脱脂，再将100 g脱脂高粱粉在65 ℃下，加入900 mL含有0.3 g偏亚硫酸氢钠的体积分数70%含水乙醇提取1 h，期间通过自动搅拌器不断搅拌。在3 300g，15 min条件下离心，取上清液。将溶剂稀释至体积分数40%乙醇水溶液并在4 ℃保持过夜以促进蛋白质沉淀[16]。在上述条件下离心后回收蛋白质沉淀，进行冷冻干燥，于-80 ℃储存备用。

1.2.2 高粱醇溶蛋白酶解物的制备

将1 g高粱醇溶蛋白溶解于装有25 mL去离子水的锥形瓶中，制备出蛋白质悬浮液（质量分数4%）。向悬浮液中添加蛋白酶，用橡胶塞密封烧瓶。预热至酶解温度后，转移到水浴摇床中[17]。反应结束后，于95 ℃水浴15 min灭酶，冷却至室温。用离心机按3 500g离心25 min，收集上清液，即为水解产物。

1.2.3 最适用酶的筛选

试验共选用4种蛋白酶酶解高粱醇溶蛋白，其最适作用条件如表1所示。通过改变酶解时间，测定高粱醇溶蛋白酶解液的DPP-IV抑制率，比较4种酶的酶解情况，确定最适用酶对其工艺条件进行优化。

表1 不同蛋白酶酶解的用量及反应条件

1.2.4 DPP-IV抑制率的测定

通过底物发色法对DPP-IV抑制率进行测定[18]。将试验分为4组，分别为阴性对照组（酶10 μL+缓冲液40 μL+底物50 μL）、空白对照组（底物50 μL+缓冲液50 μL）、试验组（酶解液40 μL+酶10 μL+底物50 μL）和试验空白对照组（酶解液40 μL+缓冲液10 μL+底物50 μL）。反应在96孔板内进行，DPP-IV质量浓度为100 ng/mL，发光底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐浓度为100 μmol/L，所用溶解液为100 mmol/L Tris-buffer缓冲液（pH 8.0）[19]。按照酶解液、蛋白酶、缓冲液、底物的顺序依次加入后，在37 ℃下预热1 h，在405 nm处测定吸光度，根据式（1）计算抑制率[20]。

式中：ΔA0为阴性对照组吸光度-空白对照组吸光度；ΔAx为试验组吸光度-试验空白对照组吸光度。

1.2.5 可溶性蛋白含量的测定

在试管中加入1 mL待测样品（稀释后），再加入5 mL Folin-酚试剂甲，室温下静置10 min，加入0.5 mL Folin-酚试剂乙，摇匀，室温下静置30 min，在500 nm条件下测定吸光度。空白以1 mL蒸馏水代替，其余操作相同。将测定的吸光度代入标准曲线方程，计算其蛋白浓度[21]。

1.2.6 单因素试验

酶解时间的确定。选用木瓜蛋白酶，按1.2.2节的方法进行酶解。将酶解时间控制在1，2，3，4，5和6 h，在温度50 ℃，pH 6.5，酶添加量6 000 U/g条件下酶解。

酶解温度的确定。选用木瓜蛋白酶，按1.2.2节的方法进行酶解。将酶解温度控制在40，45，50，55和60 ℃，在时间3 h，pH 6.5，酶添加量6 000 U/g条件下酶解。

pH的确定。选用木瓜蛋白酶，按1.2.2节的方法进行酶解。将酶解pH控制在5，5.5，6，6.5和7，在时间3 h，温度50 ℃，酶添加量6 000 U/g条件下酶解。

加酶量的确定。选用木瓜蛋白酶，按1.2.2节的方法进行酶解。将加酶量控制在3 000，6 000，9 000，12 000和15 000 U/g，在时间3 h，温度50 ℃，pH 5.5条件下酶解。

1.2.7 酶解工艺优化

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，基于单因素试验结果，以酶解时间（A）、温度（B）、pH（C）、酶添加量（D）为响应因素，酶解液DPP-IV抑制率（Y）为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法进行试验设计，因素和编码水平见表2。结果运用Design-Expert.V 8.0.6软件进行数据处理和响应曲面分析。

表2 响应面试验的因素及水平设计

1.3 统计分析

所有指标检测均选取3次结果取平均值。所得数据采用SPSS 25软件进行数据统计分析，以α=0.05和α=0.01作为差异显著水平，结果用X±SD表示。若有显著性差异（p＜0.05），则采用Duncan进行多重比较检验。用Graph Pad Prism作图软件作图。

2 结果与讨论

2.1 高粱DPP-IV肽水解酶的筛选

分别对比了4种蛋白酶水解高粱醇溶蛋白水解产物的DPP-IV抑制效果，结果如图1所示。测定了4种蛋白酶酶解液DPP-IV抑制率，其中木瓜蛋白酶酶解的酶解液DPP-IV抑制率最大。蛋白酶对水解底物的专一性表现在各种蛋白酶作用位点的不同，这可能使4种蛋白酶水解高粱醇溶蛋白后，产生具有明显差异的组成和特性的酶解产物[22]。因此，蛋白酶解液显示出DPP-IV抑制活性差异明显的现象。

图1 4种水解酶处理不同水解时间得到水解样品的DPP-IV抑制率

2.2 高粱醇溶蛋白酶解单因素条件研究

2.2.1 不同时间梯度对酶解产物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影响

测定在不同的酶解时间下高粱醇溶蛋白水解产物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的变化，结果见图2。当酶解时间为1～3 h时，随着酶解时间的延长，DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量均以较快速率递增，伴随酶解时间的不断延长，在达到3 h时，酶解产物的DPP-IV抑制活性为73.67%。随后在3～6 h时间段内，随着酶解时间的延长，DPP-IV抑制活性的变化趋势基本稳定，表现为缓慢增长后下降，无显著性差异（p＞0.05）。可溶性蛋白含量的变化也与DPP-IV抑制活性的变化趋势同步，表现为缓慢增加，无显著性差异（p＞0.05）。甲承立[23]在使用胰蛋白酶酶解乳白蛋白制备DPP-IV抑制肽时发现，随着酶解时间的积累，乳白蛋白酶解产物的DPP-IV抑制活性呈现出先升高后缓慢下降，在出现拐点的位置达到最佳抑制活性，因此该时间点为最优水解时间。出现拐点后DPP-IV抑制活性略有下降的原因，可能是伴随酶活力的下降以及加热时间的延长，水解产物中肽段出现了重新聚合现象，导致最终产物中的有效成分减少。这是由于酶解反应启动后，伴随时间延长，蛋白质水解生成的短链多肽含量增多，活性肽的抑制活性和可溶性蛋白含量也随之增大。当活性达到最大值后，随着酶解反应的继续，蛋白质水解成的短链多肽会进一步水解，可能产生小部分氨基酸，抑制肽的数量就会随之减少。试验考虑到在3 h后DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白均无显著性差异（p＞0.05），故直接选择3 h为最佳酶解时间进行后续试验。

图2 时间对酶解产物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影响

2.2.2 不同温度梯度对酶解产物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影响

测定在不同的温度条件下高粱醇溶蛋白水解产物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的变化，结果如图3所示。当酶解温度在40～50 ℃范围内变化时，可溶性蛋白含量和DPP-IV抑制率表现出递增趋势。当酶解温度升高至50 ℃时，DPP-IV抑制率达到最大值。在50～60 ℃，伴随着温度的上升，DPP-IV抑制率呈下降趋势，可溶性蛋白含量则是逐渐趋于稳定。吉薇等[24]通过响应面优化法确定动物蛋白酶水解南极磷虾制备DPP-IV抑制肽的最佳酶解工艺，其中，温度对酶解效果也呈现上升后下降的趋势。可能由于酶解温度较低，酶活性则较小，导致水解速度较慢，使酶解产物的DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量都较低；当反应温度升高后，酶的活性会增强，同时蛋白质结构的展开，促使酶与底物进行充分反应，使水解速度加快，则酶解产物的DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量都有所上升；但当温度进一步升高，伴随着酶活性的逐渐失去，水解效果也逐渐变差，酶解释放的活性多肽减少，从而使DPP-IV抑制率呈现下降趋势。

图3 温度对DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影响

2.2.3 不同pH梯度对酶解产物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影响

测定在不同pH条件下高粱醇溶蛋白水解产物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的变化，结果如图4所示。当pH在5.0～5.5范围变化时，随着pH升高，水解产物的DPP-IV抑制率呈现上升趋势，并在pH 5.5时达到最大值。当pH为5.5～6.5时，随着pH的增大，DPP-IV抑制率逐渐变小。可能由于pH的改变对蛋白质的空间结构产生影响，导致酶解产生的有效肽段在类型和数量上有明显差异，从而呈现出酶解产物的DPP-IV抑制率的差异变化。可溶性蛋白含量在此变化范围内则无显著性变化，证明在此pH变化范围内水解速度未发生明显变化，这与木瓜蛋白酶的pH可适应范围有一定的关系。

图4 pH对酶解产物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影响

2.2.4 蛋白酶添加量不同对酶解产物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影响

测定在不同的加酶量条件下高粱醇溶蛋白水解产物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的变化，结果如图5所示。在蛋白酶添加量3 000～6 000 U/g范围内，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量随着酶添加量的增加呈现上升趋势，并且在6 000 U/g时达到最大值。当酶添加量超过6 000 U/g之后，在加酶量成倍增长的条件下，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量均保持稳定的趋势，没有显著性的差异变化。这与周建敏等[25]通过碱性蛋白酶制备高粱醇溶蛋白ACE抑制肽试验中的结论类似。在蛋白酶添加量较少时，水解产物的DPP-IV抑制效果与加酶量呈正相关关系，当加酶量继续增大时，DPP-IV抑制率逐渐趋于稳定。这是由于在酶添加量较少的情况下，伴随酶量的增加，蛋白质逐渐分解完全，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量也随着逐渐增大，当蛋白酶的添加量达到6 000 U/g时，相对于底物而言，酶用量已趋向饱和，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量达到峰值，继续增加蛋白酶用量，并没有多余的底物能与之结合，最终使DPPIV抑制率和可溶性蛋白含量的数值处于相对稳定。

图5 酶添加量对酶解产物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影响

2.3 响应面优化酶解条件

2.3.1 中心组合试验结果

Box-Behnken试验设计的因素水平及结果如表3所示。

表3 响应面试验设计与结果

按照表2设计进行试验，结果见表3。根据表3的结果，设定DPP-IV抑制率为响应值，使用Design-Expert.V 8.0.6软件对响应值和各因素的编码值进行回归拟合分析，得到二次多元回归方程：

Y=89.77+2.91A+3.82B-1.28C+6.02D-0.58AB+0.36AC-0.39AD+0.96BC+0.023BD+0.43CD-2.26A2-8.79B2-3.56C2-4.44D2

对回归方程的方差分析结果见表4。从表4中可以看出，对DPP-IV抑制率所建立的回归方程模型的显著性（p＜0.000 1）极高，失拟项（p=0.077 9＞0.05）不显著，模型的调整系数R2=0.940 1，表明该模型与实际试验的拟合较好，自变量与响应面之间的线性关系较为显著，试验的误差较小，因此，可以运用该回归模型来分析和预测高粱醇溶蛋白制备DPP-IV抑制肽工艺效果。在回归方程中，各因素的系数值是直接反映每个试验因子与指标值的影响效果。由各因素的均方值可知，各因素对高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制率的影响顺序为酶添加量＞温度＞时间＞pH。从表4可以看出，方程中的一次项A、B、C、D与二次项A2、B2、C2、D2均是极显著的；交互项均不显著。综上所述，响应值的变化十分复杂，各具体的试验因素对DPP-IV抑制率的影响并非是简单的线性关系，而是二次关系。分别将模型中的A（时间）、B（温度）、C（pH）、D（酶添加量）因素其中的2个固定在0水平，可以得到另外2个因素的交互作用对DPPIV抑制率的子模型，通过观察模型得到三维曲面图，可以发现试验的交互项均对抑制率无显著影响。通过中心组合试验所得的结果与二次多项回归拟合方程，通过软件Design-Expert.V 8.0.6得出获得最高DPP-IV抑制率时各因素的最佳蛋白酶解条件：时间3.56 h、温度50.97 ℃、pH 5.46、酶添加量7 947.45 U/g。在此条件下，高粱醇溶蛋白酶解产物的DPP-IV抑制率的理论值为92.96%。

表4 回归模型的方差分析

2.3.2 响应面模型最佳条件的验证

为了验证响应面法的可行性，并考虑到操作过程中试验的具体可实施性，在时间3.6 h、温度51 ℃、pH 5.5、酶添加量8 000 U/g条件下进行验证性试验，通过重复3组平行试验，得到的高粱醇溶蛋白的DPPIV抑制率平均值为91.97%，与预测值92.96%的误差在1%以内，表明采用该响应面优化得到的酶解工艺参数模型可靠，对高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的制备具有意义。

3 结论

应用响应面法优化木瓜蛋白水解酶水解高粱醇溶蛋白制备DPP-IV抑制肽的工艺参数，结果显示，模型拟合度较高，可用于高效的高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的制备预测与优化。酶解时间、酶解温度、酶解pH、酶添加量均对DPP-IV抑制作用显著。该工艺参数条件为时间3.56 h、温度50.97 ℃、pH 5.46、酶添加量7 947.45 U/g。在此条件下，高粱醇溶蛋白的DPP-IV抑制率为91.97%，与预测值92.96%误差为0.99%。研究为高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的高效制备和功能性研究提供了参考，为高粱醇溶蛋白进一步的研究奠定了基础。