蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制机理

吴颖，王佳其，唐文，井玉林，刘晴，王露

1.上海应用技术大学化学与环境工程学院（上海 201418）；2.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院（上海 201418）

黄酮类化合物是多以游离态或糖苷类等形式存在于植物体内，含有2-苯基色原酮（flavone）结构的一类天然产物，其主要包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮类、花色素类等物质[1]，具有抑菌消炎、抗氧化及美白等多种功效[2]。黄酮类物质的美白作用机理可能是通过多种途径进行的，如黄酮化合物可作为酪氨酸酶的底物类似物与酶的活性位点结合，竞争性抑制酪氨酸酶活性，影响黑色素的形成[3]；部分黄酮类化合物通过具有还原性和亲水性的酚羟基结合酪氨酸酶分子上的二价铜离子抑制酶活。此外，黄酮化合物两个苯环上的酚羟基很容易被氧化成醌类物质，从而清除氧自由基延缓衰老。付小华[4]研究表明甘草黄酮对酪氨酸酶具有较强的抑制作用，与日化行业中常用的美白剂，如维生素C衍生物、熊果苷、曲酸等相比，甘草黄酮天然安全、毒性更低。付建红等[5]通过酪氨酸酶抑制动力学研究发现，桑叶黄酮对酪氨酸酶的抑制作用是可逆的混合型抑制。由于黄酮类化合物具有美白抗氧化、抑菌等多种功效，且来源天然安全、毒副作用小，进而成为天然美白化妆品原料的研究热点。

蒲公英是一种常见的传统药食两用草本植物，在我国很多地区均可生长，且价格低廉。文献报道蒲公英具有抗炎抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、清热解毒等多种功能[6-7]。蒲公英醇提物中含有20余种黄酮类化合物，其中槲皮素、木犀草素、芹菜素、芦丁等物质含量较高[8]。槲皮素和芦丁对酪氨酸酶均有很强的抑制作用，研究发现槲皮素和芦丁对酪氨酸酶的半抑制浓度分别为49.12和90.00 μmol/L[9-10]。关于蒲公英黄酮的提取、抗氧化、抗菌抗炎等方面的报道较多，但关于蒲公英黄酮在抑制酪氨酸酶活性及其抑制机理方面的研究鲜有报道，该文通过优化条件提取蒲公英黄酮，并研究其对酪氨酸酶活性的作用及其抑制机理等，以期开发蒲公英黄酮类物质在美白等日化产品中应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英（上海人和堂国药总店）；酪氨酸酶（美国Sigma公司）；L-多巴、熊果苷（上海泰坦科技股份有限公司）；DPPH、芦丁标准品、维生素C（上海宝曼生物科技有限公司）；无水乙醇、氢氧化钠、碳酸钠、硝酸铝等试剂（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

722S型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；RE-5299旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；JP-300B-6D型粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；TDZ4A-WS型离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 蒲公英黄酮的制备

以料液比、乙醇浓度、提取时间为单因素，优化提取蒲公英黄酮的过程为：称取蒲公英粉末约2 g，按不同料液比（1∶125，1∶100，1∶75和1∶50（g/mL）），加入一定量的乙醇水溶液，乙醇体积分数分别为55%，60%，65%，70%，75%和80%，加热回流，提取时间分别为90，120，150和180 min，抽滤，滤液经旋转浓缩后得蒲公英黄酮。优化后的最佳提取条件：乙醇体积分数为70%、料液比为1∶75（g/mL）、加热回流时间为2 h。

1.4 黄酮标准曲线的绘制

参考文献采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[11]绘制黄酮标准曲线，称取芦丁标准品10.0 mg，以体积分数30%的乙醇水溶液溶解配制质量浓度0.2 mg/mL的芦丁标准液。取不同体积的芦丁标准液，补加30%乙醇至5 mL，再分别加入0.3 mL质量分数为5%亚硝酸钠溶液和0.3 mL质量分数为10%硝酸铝溶液，混匀静置6 min后加入4 mL质量分数4%的氢氧化钠溶液，用30%乙醇补至总体积为10 mL，静置15 min，在505 nm波长下测量体系的吸光度值。空白参比对照为30%乙醇。以吸光度（A）为纵坐标，芦丁的质量浓度（C）为横坐标作图，得到标准曲线方程：A=7.25C+0.028 2，R2=0.999。

1.5 酪氨酸酶抑制率的测定

具体操作根据参考文献[12-13]所提供的方法。取1.5 mL pH为6.8的磷酸缓冲液和0.5 mL活度50 U/mL的酪氨酸酶溶液，加入1 mL不同质量浓度的蒲公英黄酮，混匀静置10 min后加1 mL 0.01 mol/L的L-多巴溶液，静置10 min后在475 nm波长处测量体系的吸光度值。以磷酸缓冲溶液为空白对照，熊果苷作为阳性对照，抑制率计算如式（1）。

式中：ODA为有酪氨酸酶但不含蒲公英黄酮组吸光度；ODB为不含酪氨酸酶和蒲公英黄酮组吸光度；ODC为含有酪氨酸酶和蒲公英黄酮组吸光度；ODD为有蒲公英黄酮但不含酪氨酸酶组吸光度。

1.6 酪氨酸酶抑制机理及动力学研究

根据李倩等[14]的方法，以0.01 mol/L的L-多巴为底物，保持其加入量1 mL，加入不同质量浓度（0，0.1，0.4，0.8，1.0和1.2 mg/mL）的蒲公英黄酮溶液，酶添加量分别为0.5，0.7，1.0和1.2 mL，按照1.5中的操作步骤，测定每个质量浓度的蒲公英黄酮溶液在不同体积酪氨酸酶下对酪氨酸酶催化氧化L-多巴能力的影响。

保持酪氨酸酶的添加量1 mL，改变底物L-多巴的浓度（1，2，4，6，8和10 mmol/L），测定不同质量浓度（0，3，4和5 mg/mL）蒲公英提取物对酪氨酸酶活力的影响，以底物L-多巴浓度的倒数（S-1）对酶反应速率的倒数（V-1）作图，绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，根据米氏方程来判断蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制作用类型以及相关动力学参数[15]。

1.7 抗氧化活性测定

参考Nasab等[16]的方法，将不同质量浓度的蒲公英黄酮溶液与0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液相混合，避光放置40 min，在517 nm波长处测定吸光度值（无水乙醇为空白对照）。

2 结果与分析

2.1 蒲公英黄酮对酪氨酸酶活力的抑制率

以最佳提取条件所得蒲公英黄酮的提取率最高为3.47%。杨岚等[17]对蒲公英花醇提取液中总黄酮含量进行测定，其总黄酮含量为3.65%，实验提取物总黄酮含量与之相当，但高于张智等[18]通过复合酶法提取蒲公英总黄酮含量为1.509%。进一步研究蒲公英黄酮对酪氨酸酶酶活的抑制作用，并以熊果苷为阳性对照，结果如图1所示。随蒲公英黄酮和熊果苷质量浓度增大，其对酪氨酸酶活性的抑制作用也增强，蒲公英黄酮对酪氨酸酶的半抑制质量浓度（IC50）约2.5 mg/mL，略优于熊果苷对酪氨酸酶的半抑制质量浓度（IC50）2.97 mg/mL。文献报道甘草提取物对酪氨酸酶的半抑制质量浓度（IC50）为2.94 mg/mL[19]，甘草提取物是目前美白日化产品中常用的天然美白剂，蒲公英黄酮的美白作用与其相当，且蒲公英作为传统药食两用植物，效优价廉，安全性极高，因而可作为一种具有良好研发价值的天然酪氨酸酶抑制剂。

图1 蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制作用

2.2 蒲公英黄酮对酪氨酸酶活性的抑制效应

以一定浓度的L-多巴为底物，添加不同量的酪氨酸酶，考察不同质量浓度的蒲公英黄酮对酪氨酸酶酶活的影响，结果如图2所示。酶活力随酶体积增加逐渐增大，在相同酶量的条件下，随着蒲公英黄酮质量浓度的增大，酶活力逐渐下降。酶活力对酶体积作图得到一组过原点的直线，且随着蒲公英黄酮质量浓度的增大，直线的斜率逐渐减小，说明黄酮提取物对酪氨酸酶活性的抑制属于可逆抑制[20]。也就是说蒲公英黄酮通过抑制酪氨酸酶活力实现降低其催化氧化L-多巴的能力，而不是通过减少有效酪氨酸酶的数量或直接使酶失去活力。

图2 蒲公英黄酮对酪氨酸酶活力的抑制机理

2.3 蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制动力学

以底物L-多巴浓度的倒数为横坐标，酪氨酸酶活力反应初速度的倒数为纵坐标，纵截距代表1/Vm（酶促最大反应速率），通过Lineweaver-Burk双倒数作图，斜率为Vm/Km（米氏常数），进而判断蒲公英黄酮对酪氨酸酶活性的抑制类型，实验结果如图3和表1所示。随着蒲公英黄酮质量浓度的增大，Lineweaver-Burk双倒数图为一组相交于第三象限的直线，直线斜率逐渐增大，Km、Vm都减小。由文献可知[21]，直线相交于第三象限、Vm值和Km值都减小，但减小的比例不同，表明蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制类型为混合型抑制。也就是说，蒲公英黄酮作为酪氨酸酶活抑制剂，既可与游离的酶结合，也可与酶与底物的络合物结合，阻止络合物分解为产物而抑制黑色素的生成。以米氏方程的斜率和截距对蒲公英黄酮质量浓度作图（图3b、3c），分别得到蒲公英黄酮对游离酶的抑制常数KI为0.021 4 mg/mL，对酶和底物络合物的抑制常数KIS为1.508 mg/mL。

图3 蒲公英黄酮对酪氨酸酶活性抑制作用的双倒数曲线

由文献[22]可知，倒数1/KI可以代表抑制剂（I）与酶（E）的亲和力，1/KIS可以代表抑制剂（I）与酶和底物的复合物（ES）的亲和力。由表1可知，1/KI＞1/KIS，说明蒲公英黄酮与酪氨酸酶的亲和力大于蒲公英黄酮与L-DOPA和酪氨酸酶的复合物的亲和力。蒲公英黄酮通过1/KIS、1/KI这两种亲和方式影响酪氨酸酶活性，一方面通过结合酪氨酸酶活性中心以外的其他基团进行非竞争型抑制；另一方面还能通过与L-DOPA和酪氨酸酶结合的复合物反应，进行反竞争型抑制，进一步说明蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制类型为非竞争型与反竞争型混合的抑制作用。根据文献[23-24]报道，木犀草素是蒲公英黄酮的主要成分之一，其对酪氨酸酶的抑制机理为非竞争型抑制，抑制常数KI为86 mmol/L。推测蒲公英黄酮中可能含有某种或某些成分对酪氨酸酶的抑制作用为反竞争型抑制，通过与木犀草素等共同作用，使蒲公英黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制表现为混合型抑制类型。

表1 酪氨酸酶抑制动力学参数

2.4 体外抗氧化活性

蒲公英黄酮对DPPH+清除结果如图4所示。随着蒲公英黄酮质量浓度增大，清除作用逐渐增大。蒲公英黄酮质量浓度为200 μg/mL时，DPPH+的清除率达到89.35%，与阳性对照VC的清除率接近，表明蒲公英黄酮具有较好的清除自由基的能力。这与张坤等[25]研究报道的蒲公英总黄酮质量浓度为9.6 mg/mL时，对DPPH自由基清除率达到80.39%的结果相近似。此外，蒲公英黄酮与常用的天然抗氧化剂茶多酚相比，也具有较好的抗氧化性能，如文献[26]报道，绿茶提取物质量浓度400 μg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到60%。酪氨酸酶的抑制机理可能与抗氧化作用有关，蒲公英黄酮的抗氧化活性也可能与酪氨酸酶的抑制机理相关。

图4 蒲公英黄酮对DPPH+的清除作用

3 结论

蒲公英是一种具有多种功效的药食两用植物，用体积分数70%乙醇可以有效提取蒲公英黄酮。在试验质量浓度范围内，蒲公英黄酮可以有效抑制酪氨酸酶的活性，其半抑制浓度（IC50）约2.5 mg/mL，抑酶活性略高于阳性对照熊果苷。蒲公英黄酮对酪氨酸酶的抑制作用表现为可逆的非竞争型与反竞争型结合的混合型抑制类型，即蒲公英黄酮通过与酶和酶-底物复合物结合的方式抑制酶活。由动力学参数可知，两种抑制酶活方式相比，蒲公英黄酮对酶的亲和能力更强。此外，蒲公英黄酮具有较好的抗氧化性能，其对酪氨酸酶的抑制作用可能与抗氧化性能有关。蒲公英是安全性极高的天然产物，且价格低廉、取材广泛，可深入进行研究开发具有美白、抗氧化等多种功效的蒲公英黄酮及其日化产品。