防己中黄酮类物质的测定及在卷烟中的应用

李国斌

华宝香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

防己为防己科植物粉防己（Stephania tetrandraS.Moore）的干燥根，性味苦、寒，归膀胱、肺经，为我国常用的中药药材，主产于浙江、广东、广西、安徽、福建等地，具有利水消肿、祛风止痛的功效[1-3]。防己中成分复杂，含生物碱、挥发油、糖类、黄酮类等，药理学研究试验表明黄酮类成分为其主要药效成分，该成分具有改善血液循环、提高免疫力的作用[4-7]。防己中的活性黄酮类物质包括芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚、异鼠李素等，其功效组分的解析及功能的进一步利用有待深入研究[8-9]。试验以不同产地防己药材为研究对象，对其活性黄酮类物质进行测定及其在卷烟中的应用。

对防己提取物中芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚、异鼠李素的测定方法主要为分光光度法，但分光光度法用于测定单一黄酮物质的量或浓度，估算混合物或提取物中总黄酮物质含量，不能对各种黄酮物质分别定量；薄层色谱法和柱层析法能对多种黄酮物质进行分离，虽然成本可控，但耗时长，难以控制重复性和准确率；高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、样品用量少等优点，是应用最广也最适用于黄酮物质的分离测定方法。

试验采用高效液相色谱、梯度洗脱及灵敏度更高的DAD检测建立防己提取物中5种黄酮物质的测定方法，并对其精确度、回收率等进行评价；比较不同来源防己提取物对其5种黄酮物质含量的影响，以期为防己提取物的利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

美国瓦里安PROSTAR230高效液相色谱仪（配有输液泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气装置及化学工作站）；高速万能粉碎机（潍坊市精华粉体工程设备有限公司）；离心机（卢湘仪集团）；涡流混合器；电热鼓风干燥箱（上海一恒公司）；AL2002电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；0.45 μm及0.22 μm针头微孔滤膜过滤器、乙酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）（均购自美国TEDIA公司）；Biocel型密理博超纯水系统（美国密理博公司）。

1.2 标准溶液及流动相的制备

1.2.1 黄酮物质标准品

芦丁（纯度≥99.0%）、槲皮素（纯度≥99.0%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（纯度≥99.0%）、山奈酚（纯度≥99.0%）、异鼠李素（纯度≥99.0%）（均购自Flucker公司）。

1.2.2 标准品储备液

以密理博超纯水配制黄酮物质标准品质量浓度0.1 mg/mL，并于4 ℃冰箱储存；分别取以上标样液，用密理博超纯水配制成质量浓度分别为0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1 000.0 mg/L标准品工作液，于4 ℃冰箱储存。流动相A相，0.25%乙酸水溶液；流动相B相，90%甲醇水溶液。

1.3 色谱分析条件

SYMMETRYSHIELD RP18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～5.0 min，90%～80% A；5.0～35.0 min，80%～0% A；35.0～40.0 min，0%～90% A。进样量10.0 μL；流速0.80 mL/min；DAD检测波长282 nm；柱温40 ℃。

1.4 防己提取物样品处理

防己提取物的配制：分别称取2.000 0 g水提法得到的广东潮州产防己提取物、广西崇左防己提取物、湖南郴州产防己提取物、湖北潜江产防己提取物，用40 mL 90%甲醇水溶液，溶解于100 mL棕色容量瓶中，置于摇床上振荡提取40 min；静置10 min，将有机相层转移并在25 ℃定容到100 mL后，储存于1～4 ℃冰箱，用前稀释到所需浓度。

1.5 供试样品溶液的制备

将1.4小节得到的提取液以滤纸过滤，将滤液用90%甲醇水溶液定容于25 mL容量瓶，摇匀后0.45 μm滤膜过滤，以10 000 r/min离心10 min后再用高效液相色谱分析，外标法定性定量分析。

2 结果与讨论

2.1 标准品和供试样品色谱图

基于该方法的色谱条件结合DAD检测器对5种黄酮类物质标样进行最大吸收光谱扫描，扫描波长190～400 nm。分析不同黄酮类物质的最大吸收光谱，5种黄酮类物质在282 nm左右均有较大吸收峰，因此，选取282 nm作为黄酮类物质的定量检测波长。按照方法提供的液相色谱分离和分析条件，分别精密吸取标准品溶液和广东潮州产防己提取物、广西崇左防己提取物、湖南郴州产防己提取物、湖北潜江产防己提取物供试样品溶液各10.0 μL，自动进样器进样，分析结果如图1所示。结果表明，在上述色谱条件下，色谱峰尖锐，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.7，理论塔板数均大于3 400，满足黄酮类物质定量要求。

图1 黄酮类物质混合标样（A）和广东潮州产防己提取物样品液相色谱图（B）

2.2 检测方法学考察

2.2.1 线性范围及检出限

精密吸取混合标准品溶液，分别稀释0，5，10，20，50和100倍，吸取6种浓度的标准品各10.0 μL进行测定。以各色谱峰峰面积积分值（Y）对其浓度（X）进行线性回归。结果显示，5种成分至少在0.03～200 mg/L的线性范围内线性关系良好（r＞0.990 0），检出限（S/N=3）在0.004～0.04 mg/kg，回归方程、相关系数见表1。

表1 黄酮类物质的线性关系（n=6）

2.2.2 精密度试验

精密吸取10.0 μL标准品，连续进样6次，分别记录5种组分的峰面积，计算得芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚和异鼠李素的δRSD（n=6）分别为2.97%，1.76%，3.11%，2.47%和2.97%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

取广东潮州产防己提取物供试样品溶液，在0～24 h内每隔2 h进样1次，分别记录5种组分的峰面积，计算得芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚和异鼠李素的δRSD（n=6）分别为2.36%，3.77%，3.62%，2.85%和1.42%，表明供试样品溶液中5种组分在24 h内稳定。

2.2.4 重复性试验

精密称取6份广东潮州产防己提取物样品，制备供试样品溶液，在高效液相色谱下测得芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚和异鼠李素的δRSD（n=6）分别为3.36%，2.66%，3.29%，2.64%和3.25%，表明该方法重现性良好。

2.2.5 加标回收率试验

取6份广东潮州产防己提取物（芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚和异鼠李素含量分别是92.82，12.53，9.78，31.89和16.48 mg/kg，总计黄酮物质含量为163.49 mg/kg），每份3.00 g，精密称定，置于50.0 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入3个不同浓度的芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚、异鼠李素标准品（10.0，50.0和100.0 mg/kg），按照前述制备供试样品溶液，在高效液相色谱的色谱条件下进样测定，计算回收率的结果如表2所示。结果显示，芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚和异鼠李素的平均回收率（n=6）分别为87.76%，89.45%，105.27%，102.36%和89.33%；δRSD（n=6）分别为2.18%，1.30%，2.55%，2.45%和3.34%。

表2 防己提取物加标回收试验结果

2.3 实际样品检测结果

分别取上述防己提取物样品，制备供试样品溶液，在高效液相色谱下进样测定，计算5种组分的含量，结果见表3。

不同防己提取物中芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚、异鼠李素总含量由高到低为防己（广东潮州）＞防己（湖北仙桃）＞防己（湖南郴州）＞防己（湖北潜江）。

3 防己提取物在卷烟中的应用

广东潮州产防己提取物、广西崇左防己提取物、湖南郴州产防己提取物、湖北潜江产防己提取物分别在卷烟中按加表香的形式添加0.01%，储放2 h后，制备成卷烟，进行感官评价，其结果如表4所示。

表4 不同防己提取物在卷烟中的作用评价

4个地区产的防己提取物都有增加烟气浓度、香气量和厚实性的效果，不同地区防己提取物香味和口感有所不同，广西崇左产防己提取物会带点青滋香，偏酸，尖刺会表现出来；湖南郴州产防己提取物浓度、爆发力更强，烟气也会粗犷些，同时喉部会刺激大；湖北潜江产防己提取物浓度、香气量和厚实都有所增加，但烟气显得沉闷些，余味干净度不够；广东潮州产防己提取物综合指标比较好，没有明显的负面作用。

以广东潮州产防己提取物在不同档次卷烟中添加不同用量进行比较，选择最佳投放量和应用效果。按添加量0.005%，0.010%，0.015%和0.020%分别加入中档和高档卷烟进行对比评价。在中档卷烟中，添加量0.005%时，浓度、香气量略有增加，细腻度较好，口感较舒适；添加量为0.010%和0.015%时，增加浓度、香气量和厚实性差别不明显，口感也无明显差异，添加量为0.015%时体现防己提取物的个性香味稍微高一点；添加量为0.020%时，防己提取物的个性香味显现，但有一点抑制烟草本香的负面效果，有变粗、浓的趋势。中档卷烟一般追求浓度、香气量和满足感，总之防己提取物添加量为0.010%和0.005%时效果均不错，但添加量0.010%更合适中档卷烟。高档卷烟一般要求香气质高、香气量足，口感好，故在高档卷烟中防己提取物添加量0.005%效果最佳，香气优雅细腻谐调，口感也较好。

4 结论

试验采用高效液相色谱法同时测定防己提取物及不同来源得到的防己提取物中芦丁、槲皮素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山奈酚、异鼠李素5种黄酮物质的含量，初步比较不同提取方法对5种黄酮物质含量的影响。检测方法显示，5种成分至少在0.03～200 mg/L的线性范围内线性关系良好（r＞0.990 0）；检出限（S/N=3）在0.004～0.04 mg/kg，加标回收率在87.76%～105.27%，检测方法灵敏有效。相对而言，广东潮州产防己提取物的功效最为明显，这与对黄酮物质中含量的试验结果一致。

不同来源防己提取物在卷烟中的功能作用基本类似，都有增加香气量、浓度和厚实度的效果，但是刺激性和余味上及烟气的细腻度上表现有所差异。相对来说广东潮州产防己刺激性增加不明显，余味还保持较干净舒适，烟气细腻度较好，综合品质及在卷烟中的应用价值比较高。通过在不同档次卷烟中不同添加量的试验，防己提取物在中档卷烟中添加量为0.010%时最佳，在高档卷烟中添加量0.005%最佳。