植物内生放线菌及其次级代谢产物的研究进展

刘文凯，王家敏，乔自林，郭鹏辉，王明明

(1.西北民族大学 生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学工程学院，甘肃 兰州730030)

天然产物在新药研发过程中起着举足轻重的作用，而土壤是其开发的主要来源.驻留在植物组织内的微生物，称为内生菌，而放线菌产生天然产物的比重较大.目前发现的放线菌虽然有20 000多种，但对于避免重复检测却变得越来越困难，还耗费时间、资源.因此研究者就从植物中分离放线菌及次级代谢产物，如抗生素、抗肿瘤物质、保护激素、生长激素等.近年来，从放线菌次生代谢产物中发现了很多具有商业价值的活性物质，但无较大研发进展，原因是放线菌传统筛选方法效率低.为了提高生产效率，需将基因工程、代谢工程等运用到放线菌的生产中.本文就植物内生放线菌次生代谢产物的功能及生产效率加以综述，以期为研究和生产有益菌提供参考.

1 植物内生放线菌代谢产物生物学活性

微生物是抗生素的主要来源，而耐药性却是影响药物的主要因素，也是影响人类公共卫生和动物健康的一个主要问题.人类对抗生素的生产和使用促进了耐药病原菌的产生，而只有1%～3%的天然产物抗菌剂是已知的.为解决天然的未知的抗菌剂，人们在不断探求寻找新的抗生素类化合物.

1.1 抑菌作用

作为天然抗生素最主要的来源，无论是人类病原菌还是植物病原菌、植物内生放线菌均展现出杰出的抗菌活性.Long H从Solawam sp.根中分离到73个内生菌株对被测植物致病菌有广泛的抑制作用，对革兰氏阳性致病性菌的抑制作用最强.这些菌株具有抑制各种致病性细菌生长的能力，是潜在的生物防治剂[1].Solecka J等也从植物中发现的398株放线菌，10%～20%的代谢产物对原虫有少量抗性[2].放线菌产生的抗菌剂具有对病原菌的毒害作用，却对人体无害等特点.有研究者用纸片法探究了植物发酵液样品产生抑菌和抗真菌化合物的能力.研究表明，放线菌可通过产生次生代谢产物来控制病原性入侵的抗性机制.从柑橘果实中分离到的TQR12-4菌株具有抑菌活性，对试验病原菌、白地霉菌、尖孢镰刀菌和镰刀菌均有抑制作用.2019年从同地区药用植物中提取的放线菌，培养出的LGMB471对枸橼酸有明显的抑制作用，且只对柑橘果实具有显著的抗菌活性[3].表 1提供了近10年来植物内生放线菌的抑菌活性，以供研究者参考.

表1 2010—2020年间植物内生放线菌抑菌性研究情况

1.2 抗疟疾作用

疟疾是公共卫生全球性的一项巨大挑战，每年报告的新感染病例和死亡人数达百万.由于寄生虫对已有的抗疟疾药物会产生耐药性，这就使得疟疾的传播不能及时阻断.Baba M.S分离的提取物(SUK8、SUK10和SUK27)具有抗疟疾活性.他从卵圆索树树皮中得到的链霉菌(Streptomyces SUK10)对试验菌有抑制作用，并对感染贝尔赫疟原虫的小鼠进行了抗疟试验.链霉菌的核苷酸序列和系统发育树表明，SUK10可能是链霉菌属中的一个新种[4].Streptomyces hygroscopicus Hygroscopicus是放线菌家族中的一员，Fitri L E将小鼠分为1个对照组(白芍感染后不治疗组)和3个治疗组(白芍感染后腹腔内给药)，从第一天的疟疾诱导到最后一次诱导与治疗进行测量.结果表明，代谢物中的伊潘霉素可抑制其UPS功能，引起应激和死亡，是潜在的新型疟疾药物[5].

1.3 保护作用

内生放线菌代谢产物能有效抑制植物病原菌，从而保护寄主植物免受病菌的侵袭.Tena A R从丛枝菌根真菌(AMF)对辣椒植物生长和枯萎病的抑制作用进行了研究.她在温室条件下进行盆栽试验，并对Cerro del Metate菌根结合物和ABV 39和ABV 02放线菌进行了鉴定.结果表明，AMF与放线菌共接种在辣椒植株上能够促进植物生长并具有抵抗枯萎病的协同作用[6].在一项涉及260株内生放线菌的研究中，发现80%的可抑制植物病原体.Kaur T从旁遮普邦和喜马恰尔邦的不同植物中分离出321株菌株.在初步筛选(双培养法)中，83株菌株拮抗一种或多种植物病原真菌.对植物生长促进活性的研究表明，12株具有产生吲哚乙酸的能力，10株产生铁磷，12株具有产氨能力.这些菌株可作为生物防治和植物生长促进剂[7].Haque M A从大白菜品种(SS、HN、TP)叶片中发现内生细菌群落，分离出的(TPL 08)和枯草芽孢杆菌(SSL 16，HNL 10)可通过抑制病原菌对大白菜幼苗的感染起到保护作用[8].

1.4 抗肿瘤作用

根据世界卫生组织报道，癌症是全球危害人类健康且导致死亡的十大主要原因之一.因人体对化疗药物耐药性的不断增强，且化疗药物具有毒性和副作用，所以寻找新型药物减少化疗的不良反应是癌症治疗的优先目标.20世纪40年代至2006年间批准的175种抗癌药物中，42%是天然产物或由其衍生的化合物[9].1993年Stierle等第一次从短叶紫杉的树皮中提取紫杉类化合物.这一发现为利用紫杉醇生产药物提供了途径，从而掀起了放线菌抗肿瘤研究的热潮.Caruso等从红豆杉植株中提取抗肿瘤物质，得出红豆杉烷类物质的合成途径，但其调控机制尚待研究.Xiao J从福建漳州红树林沉积物中分离出163株放线菌，并用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和3株肿瘤细胞(BEL 7402、A 549和HL 60)对分离菌株的抗微生物活性和抗肿瘤活性进行了检测.研究发现，42.3%的放线菌发酵液具有抗菌活性，37.4%的放线菌发酵液具有抗肿瘤活性[10].Vochysia divergens是一种常见于潘塔纳尔地区的巴西药用植物.Haminiuk C从Vochysia divergens中分离出的两个菌株能够产生具有抗氧化活性的次级代谢产物，对成釉瘤细胞具有抵抗活性[11].

1.5 促生长作用

放线菌具有产生多种高价值抗生素、有机酸、植物激素、胞外酶和生物活性化合物的次生代谢物的能力.多种放线菌能直接促进植物生长，保护植物免受植物病原和害虫的侵害.Liotti R G从泡菜中分离出11种内生放线菌，可促进辣椒植株生长，能使茎的质量增加42%.红链霉菌R132是辣椒采前和收获后促进生长和病原生物防治的有效工具[12].El-Tarabily K A在温室条件下测试了29种内生菌.当单独或组合使用时，它们能够显着地促进植物的生长，还可减少黄瓜的根冠与根腐病.与单独暴露在单个菌株的情况相比，三种分离株的组合可显着地抑制疾病和促进植物生长[13].Long H H从甘蔗植物中分离出83种内生放线菌，均具有促进植物生长的特性，包括吲哚-3-乙酸(IAA)和铁载体的产生、磷的增溶和对植物病原真菌的拮抗作用[14].Jog等人从小麦内生菌中分泌的植酸酶以及磷活性物质可显著改善植物的生长状态.除了磷，植物也可依靠磷铁复合物的形式提高铁的利用率.小麦放线菌代谢产物可显著提高植株生长量和矿物质(Fe、Mn、P)的含量.

2 放线菌次级代谢产物产量研究

突变和重组的研究对于提高放线菌次级代谢产物的产量仍然有效，分子遗传学方法可减少步骤，并提供基因调控和次级代谢物生物合成.这些信息可用于指导菌株改良策略，并将随机诱变、选择和重组与分子克隆相结合，以优化产品产量.在长期生产实践中，逐渐积累了提高放线菌次生代谢产物产量的方法，主要有基因工程技术优化、维生素优化及发酵工艺优化等.

2.1 基因工程技术优化

20世纪70年代兴起了基因工程技术，而现阶段在分子水平上逐步对微生物进行改造，并通过基因重组来提高产量.其原理主要为改良分子遗传方法(见图1).FK 520(Ascomycin)是一种大环内酯，具有免疫抑制活性.Yu Z使得丙二酰辅酶的乙酰辅酶(ACCase)在SFK-6-33中的过表达，使FK 520的产率提高到3 320.1 mg/L，但对FK 523的合成没有明显的抑制作用.为进一步提高FK 520的产量，构建了FkbS和ACCase的过表达组合菌株SFK-OASN.FK 520产量比SFK-6-33提高了44.4%，达到3 511.4 mg/L.这些结果表明，传统诱变结合代谢工程是提高FK 520产量的有效策略.Tn5099和Tn5096为编码外向阅读启动子活性元素.这些反式子能够激活邻近插入位点的基因转录.对S.roseosporus中的插入研究表明，某些突变体过量会产生红色素(一种次级代谢产物)，另一些突变体过量会产生脂肽抗生素如达托霉素，而有些情况还会使两者都产生.这种次级代谢产物产量的增加可能是因便携式启动子的活性或负调控元件的失活而发生.Tn5099可以与侧翼的DNA一起克隆到大肠杆菌中增加产量.而Tn5096和Tn5099都具有广泛的宿主范围，可通过接合或转导在大肠杆菌的载体上引入链霉菌[15].红霉素产量的提高一直受到基因工程方法的限制.Benjamin Kirm利用蛋白组学方法筛选了参与红霉素生物合成的调节蛋白.有学者已鉴定出一种调节蛋白SCE-5599.鉴定出的这种合成蛋白与野生型相比，该蛋白在红霉素高产菌株中的表达水平显著提高.除此之外，SACE-5599对红霉素产率有积极影响，BldD和SACE-5599参与了次生代谢产物的生物合成.虽然SACE-5599的作用机制尚未阐明，但已显示出具有提高红霉素生产的潜力[16].

图1 菌株改良的分子遗传方法

2.2 发酵工艺优化

2.3 维生素优化

就抗生素产量提高而言，目前常采用的方法是优化发酵工艺，但也可通过添加维生素提高次生代谢产物的产量.IStreptomyces/I是革兰氏阳性细菌，对许多抗生素和次生代谢物的生产具有重要意义.脱铁胺(亦称去铁胺B、DFO-B、DFOA、DFB或Desferal)是由多种放线菌产生和分泌的低分子量铁螯合物，包括IStreptomyces/I、Incartomyces/I和IMicromonospora/I.IStreptomyces pilosus/I合成的铁螯合物B，临床上用于治疗与铁超载和病理铁沉积有关的疾病.Vijayakumar R将大豆作为添加剂，如NaSUB 2/SUBHPOSUB 4/SUB.12HSUB2/Subo，NaHSUB 2/SUBPOSUB 4/SUB 4等，氨基酸产量与对照相比提高了8倍左右[20].紫杉醇是从红豆杉皮中提取的一种高效而罕见的抗肿瘤药物，但其提取方法成本高、产率低，限制了它的广泛应用.Qiao W发现NaOAc是紫杉醇的重要前体，可在培养基中引入NaOAc、Cu2+和水杨酸，Cu2+可增强氧化酶活性，能催化紫杉醇的形成.水杨酸可作为诱导子信号[21].

2.4 其他微生物优化

植物次生代谢产物的产生需要叶绿体和膜功能的作用，更需要其他微生物的调节.Raupach[22]发现，经过7种根杆菌(PGPR)菌株处理的黄瓜都具有显著生长，且所有经过PGPR治疗的黄瓜都显着地降低了叶病的严重程度，进而提高生产效率.Vijayakumar R[23]对采集的25份放线菌样品进行了分离，获得68株形态不同的菌株，其中37%具有抗菌活性，取名为链霉菌VPTS3-1.其对细菌和真菌病原体具有抗菌效果.此外制备工艺参数表明，在淀粉-酪蛋白培养基中，适宜的pH值为7～8，培养时间为9 d，适宜的碳源为淀粉，氮源为KNO3，可为大规模生产提供培养条件.

3 总结与展望

放线菌及其代谢产物是维持生命的关键，也是自然过程的驱动力.将放线菌及其代谢次生物用于抵抗各种病原体的侵入和生物虫害，还可参与纳米材料的大规模生产并能促进生产效率的优化.他们的生物合成潜力已被充分认识，不再被认为是无研究价值的放线菌群，还具有无限的发展潜能.随着生物与化学技术的不断发展，新型筛选技术将更具有针对性，并能减少重复概率，还可使代谢产物的产量进一步提高，达到可控的效果.

目前对放线菌及其代谢产物的研究应用远远不够，还需要关注新的菌种，如链球菌、乳杆菌在代谢产物方面的应用；新领域微生物资源的开发，对植物相关菌种在不同条件下的代谢产物的产能和应用，以及对新型代谢途径的研究；还如链球菌在脱硫方面的不同代谢途径是否可产生不同的代谢产物等等.这些不同方面的探索可促进对放线菌代谢产物的深入研究.无论在农业、医疗还是工业领域，放线菌属都有广阔的应用前景和开发空间，值得深入研究.