鸭凝血因子Ⅷ的原核表达及多克隆抗体制备

刘 英，唐小涓，刘静静，张雯瑾，赖泓江，李德龙，2*

（1. 西南大学动物医学院，重庆402460；2. 西南大学医学研究院免疫学研究中心，重庆402460）

鸭疫里默氏菌（Riemerellaanatipestifer）是严重危害养鸭业的疫病之一，极易感染2~3周龄雏鸭[1-3]。鸭感染鸭疫里默氏菌后以严重肝损伤为主要特征，表现为典型的纤维素性肝包炎、内皮细胞损伤、血管通透性增加。内皮细胞是血管壁的重要组成部分，在调节血流、血小板激活、白细胞黏附等过程中发挥重要作用[4-5]。内皮细胞功能障碍是多种渗出性炎症发生过程中的促进因素，因此分离得到鸭肝窦内皮细胞对研究R.anatipestifer 致病机制有重大意义。Ⅷ因子常用来鉴定肝窦内皮细胞。但是，目前Ⅷ因子相关试剂和试剂盒主要集中在人或小鼠上，市面上缺乏鸭Ⅷ因子的相关试剂。因此，本研究拟制备鸭凝血因子Ⅷ多克隆抗体，为后续鸭肝窦内皮细胞鉴定提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

6~8周龄试验小鼠购自西南医科大学实验动物中心。

1.1.2 试剂

HRP 标记的山羊抗鼠IgG 购自Sigma 公司；DNA Ligation Kit、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鸭Ⅷ因子克隆与分析

根据NCBI 鸭Ⅷ因子序列（GenBank 登录号XM_027465529.1）设计6 对引物，分段扩增Ⅷ-1、Ⅷ-2、Ⅷ-3、Ⅷ-4、Ⅷ-5和Ⅷ-6，并设计相应引物，见表1。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

雏鸭放血处死后，采集肝脏，提取总RNA，反转录为cDNA 后 PCR 扩增。反应条件：94 ℃ 4 min，（94 ℃ 30 s，52~55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min）×35 个循环，72 ℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将回收的目的片段与T-载体连接，转化至E. coliDH5α，涂布LB 平板（Amp+），挑取单菌落，摇菌后提取质粒，鉴定正确后送武汉金开瑞生物工程有限公司测序，并利用生物学软件进行分析。

表1 鸭Ⅷ因子各基因片段引物序列Tab.1 The primer sequences of each gene fragment of duck factor Ⅷ

1.2.2 重组蛋白的诱导表达

根据抗原表位软件对鸭Ⅷ因子进行分析，发现其主要抗原表位位于C端，另依据E.coli最适密码子进行合成，即Ⅷ-C（m）。以pET-32a(+)构建重组表达质粒pET-Ⅷ-C(m)，转化至E. coliBL21（DE3），挑菌，37 ℃ 摇菌至OD≈0.8；IPTG（1.0 mmol/L）诱导后离心，PBS重悬，菌体经超声破碎后离心，收集上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE。

1.2.3 免疫抗原制备

Ⅷ-C（m）经SDS-PAGE分离，切取凝胶条带，烘干，研磨，加0.9%生理盐水充分匀浆，制备免疫抗原。

1.2.4 多克隆抗体制备

将16 只小鼠随机分为2 组，每组8 只，分别皮下注射Ⅷ-C（m）和0.1 mL PBS。以相同剂量加强免疫2 次，每次加强免疫间隔14 d。试验结束后处死小鼠，分离血清备用。

1.2.5 多克隆抗体效价检测

将Ⅷ-C（m）用pH 值9.6 碳酸盐缓冲液稀释（5 mg/L），4 ℃过夜；5%脱脂奶粉封闭，37 ℃孵育2 h；鼠抗Ⅷ-C（m）血清，37 ℃孵育 1 h；HRP 标记山羊抗鼠 IgG，37 ℃孵育1 h；TMB避光显色15 min，2 mol/L H2SO4终止反应。判定标准：S/N=（样品OD450）（/阴性对照OD450），S/N>2.1 为阳性。

2 结果与分析

2.1 Ⅷ-C克隆与序列分析（见图1）

由图 1 可知，PCR 扩增后得到 1 个 993 bp 的片段，经NCBI BLAST 比 对 ，与 鸭 Ⅷ（GenBank 登 录 号 XM_027465529.2）的相似性为99.39%。结果显示，成功获得Ⅷ-C基因。

图1 Ⅷ-C基因的PCR产物Fig.1 PCR product of Ⅷ-C gene

2.2 重组蛋白的检测（见图2）

由图2可知，pET-Ⅷ-C(m)/E.coliBL21经IPTG诱导，SDS-PAGE可检测到约为54 kDa的重组蛋白，与预期重组蛋白pET-Ⅷ-C（m）大小一致。

图2 pET-Ⅷ-C（m）/E.coli BL21重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 The analysis of recombinant protein of pET-Ⅷ-C(m)/E.coli BL21 by SDS-PAGE

2.3 免疫抗原制备（见图3）

图3 pET-Ⅷ-C（m）/E.coli BL21切胶纯化制备免疫抗原Fig.3 Preparation of immune antigen of pET-Ⅷ-C(m)/E.coli BL21 by gel purification

由图3 可知，切取Ⅷ-C（m）条带，烘干，研磨，使用0.9%生理盐水充分匀浆，制备免疫抗原。

2.4 鼠抗C4BPα(m)多克隆抗体ELISA结果（见表2）

由表2 可知，多克隆抗体在稀释度1∶104S/N 均大于2.1，因此鉴定为阳性，同时效价大于1∶104，但小于 1∶105。

表2 鼠抗C4BPα（m）多克隆抗体ELISA结果Tab.2 Detection of polyclonal antibodies of mouse anti-C4BPα(m)by ELISA

3 讨论

R.anatipestifer 主要危害2~8 周龄雏鸭，给我国养鸭业造成巨大经济损失[1-3]。鸭传染性浆膜炎以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为主，在纤维素性渗出物中有多量炎性细胞浸润，主要是异嗜性粒细胞和巨噬细胞[6-9]。目前，R.anatipestifer 已经发现21 个血清型，并且随着研究的深入，新的血清型也不断出现[10-12]。R.anatipestifer 各血清型菌株间交叉免疫保护较差，因此疫苗免疫效果不佳。R.anatipestifer 极易产生耐药性，一旦发病，抗生素治疗作用不明显[13-16]。因此，只有尽快阐明其致病机制，才能找到新的防治措施。R.anatipestifer 感染主要引起广泛性的纤维素性渗出性炎症，而渗出性炎症发生的病理学基础在于血管内皮细胞损伤，致使血管通透性增加。另外，R.anatipestifer 感染主要引起雏鸭严重肝损伤，以纤维素性肝周炎为主，同时伴有肝索结构紊乱、肝细胞变性坏死、肝窦扩张淤血等病理变化。因此，阐明R.anatipestifer感染致肝窦内皮细胞的机制尤为重要。分离肝窦内皮细胞后需要进行鉴定，而Ⅷ因子多抗常被用来鉴定肝窦内皮细胞。但是，目前Ⅷ因子相关试剂和试剂盒主要集中在人或小鼠上，市面上缺乏鸭Ⅷ因子的相关试剂。因此，本研究通过制备鸭Ⅷ因子多抗，为鉴定鸭肝窦内皮细胞提供试验材料。

Ⅷ因子分子量较大，因此直接表达后进行纯化难度较大。本研究根据抗原表位预测软件对鸭Ⅷ因子全基因组序列进行分析，发现其抗原表位主要位于C 端。因此，对鸭ⅧC端（Ⅷ-C）进行密码子优化、原核表达，免疫小鼠制备多抗，并测定其效价。另外，在制备小鼠免疫抗原时，应用切胶纯化，操作方便、成本低，同时获得的多抗效价大于1∶104，说明多克隆抗体制备成功，可以满足后续试验需要。

4 结论

本试验结果表明，成功扩增出Ⅷ-C基因；SDS-PAGE可检测到约为54 kDa的Ⅷ-C（m）重组蛋白；ELISA检测多抗效价>1∶104。本研究为后续鸭肝窦内皮细胞鉴定提供试验材料。