华蟾素干预下化疗药物对BRAFV600E基因突变型甲状腺乳头状癌细胞的生物学影响

曹新春 郭伟胜

BRAFV600E基因突变型甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid cancer，PTC）在所有PTC病例中占40%～80%[1]，具有较高的复发率和较低的生存率，预后较差[2，3]。目前国内外公认PTC的主要治疗方式为甲状腺部分或完全切除术，其次通过用放射性131I治疗消除残余甲状腺癌组织，术后终身服用甲状腺激素替代治疗，可以使大部分患者的5年生存率提高到97.8%[4]，但同时要面临手术并发症较多的风险。中药华蟾素是从中华大蟾蜍蟾酥中分离出的天然药物，具有清热解毒、消肿、止痛、提高机体免疫力等功能。目前华蟾素在临床上主要应用于肝癌、肺癌、食管癌等肿瘤的综合治疗中，但BRAFV600E基因突变的高风险PTC的相关中医药治疗研究中较少。本研究从华蟾素对BRAFV600E基因突变型PTC增殖、迁移、侵袭的影响及其分子机制展开研究，以期揭示华蟾素在BRAFV600E基因突变型PTC的发生发展中的作用机制，为PTC的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂细胞培养箱（美国Thermo公司）；流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）；NanoDrop 2000（美国Thermo公司）；华蟾素注射液（安徽金蟾生化股份有限公司）；DNase I、RNase A、Trizol（Invitrogen公司）；DMEM培养基（美国Invitrogen公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（德国Sigma公司）；CCK-8细胞检测试剂盒、Fast-FusionTMClonase（广州复能基因有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏及培养 所用细胞为BRAFV600E基因突变型人PTC细胞B-CPAP，使用添加10%胎牛血清+1%双抗的RPMI-1640于37℃、相对湿度95%、5% CO2恒温培养条件下进行常规培养。将细胞进行传代使细胞的融合度达到80%～90%，根据细胞的密度决定传代的数量。

1.2.2 CCK-8细胞活力检测 将制备好的细胞悬液接种到96孔板中，培养2h后加药处理。分为6个组，所有组均予DMSO，对照组（无其他处理）、20nM华蟾素处理组、0.25nM阿霉素处理组、0.25nM卡铂处理组、20nM华蟾素+0.25nM阿霉素处理组、20nM华蟾素+0.25nM卡铂处理组。将6种处理的96孔板分别置于37℃培养箱，于5%CO2条件下培养，培养24h、48h、72h时分别加入CCK-8溶液10μl，孵育3～4h。在酶标仪上测定细胞的吸光值（450nm波长处）。以上实验各重复3次。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 采用流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI联合标记)检测细胞凋亡情况：根据CCK8细胞活力检测结果，选取适当浓度进行后续试验，将经华蟾素注射液处理48h的实验组及对照组的B-CPAP细胞分别收集于离心管中，于室温下1 000r/min离心5min，弃上清液，用预冷的PBS洗1次，经400目筛网滤过后移入已硅化的玻璃管中，取1×106个细胞，1 000r/min离心5min，洗涤细胞，弃上清，加入5μl AnnexinV-FITC染色剂，混匀后避光，室温孵育15min，上机前5min加入碘化丙啶（PI）染色剂，于4℃下避光染色，4h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 细胞迁移检测 采用细胞划痕实验检测华蟾素对BRAFV600E基因突变型人PTC细胞B-CPAP迁移能力的影响。首先取细胞密度约为1×105的细胞悬液1ml接种于6孔板中，培养24h，待细胞贴壁后加入RPMI-1640培养液，使形成单层细胞，用10μl无菌枪头在单层细胞上垂直划线，沿壁缓慢加入PBS清洗脱落的细胞，向对照组加入100μl PBS，实验组加入不同浓度的华蟾素，置于5% CO2培养箱37℃培养，于培养刚开始和培养后48h对细胞进行观察拍照。

细胞迁移率RM=（Wi-Wf）/Wi，RM为细胞迁移率，Wi为0h划痕宽度，Wf为48h划痕宽度。

1.2.5 细胞侵袭实验 采用Transwell实验检测华蟾素对B-CPAP细胞侵袭能力的影响。细胞进入对数生长期后，将血清撤除24h，使其饥饿，逐步消除实验过程中血清可能造成的影响；用PBS对细胞进行3次洗涤后，使用0.25%胰消化酶处理，消化停止后离心收集细胞，将培养液上清移除，用PBS洗涤3次，导入2ml无血清培养基，充分制备所需单细胞悬液，将细胞浓度调整至2×105个/ml；将100μl和500μl不同浓度的华蟾素注射液分别加入上、下室，各组设定复孔共3个；将细胞置于恒温培养箱，37℃孵育，对小室内细胞进行观察，培养24h和48h时分别分组将细胞从小室取出，结晶紫染色后计数；小室风干之后反转，用倒置显微镜显微观察，随机选择观察视野5个拍照并计数，以穿过膜的细胞数目来评估细胞的侵袭能力。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，每组数据以均数±标准差（±s）表示，采用LSD-t检验和单因素方差分析进行数据之间的比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 华蟾素对PTC细胞的迁移和侵袭影响细胞划痕实验结果显示（见图1），对照组的RM为0.98±0.069，20nM华蟾素处理后的RM为0.97±0.185，两者比较差异无统计学意义（t=0.124，P=0.912）。Transwell实验结果见图2，对照组的细胞数为（476±76）个，华蟾素处理组细胞数为（453±46）个，差异无统计学意义（t=0.5789，P=0.5786）。

图1 细胞划痕实验结果

图2 Transwell实验结果

2.2 华蟾素对PTC化疗敏感性影响采用CCK-8细胞活力检测试剂盒对华蟾素干预后化疗药物阿霉素或卡铂处理下B-CPAP细胞的细胞活力进行检测。细胞活力结果显示（见表1），20nM华蟾素与0.25nM阿霉素联合干预下的B-CPAP细胞在72h的OD450值为0.555±0.041，显著低于阿霉素处理下细胞的OD450值0.753±0.053（t=5.118，P=0.0069）；而72h的华蟾素与卡铂联合干预下的B-CPAP细胞的OD450值为0.620±0.093，与卡铂处理下细胞的OD450值0.657±0.070比较差异无统计学意义（t=0.5506，P=0.6112）。华蟾素与卡铂联合干预下的B-CPAP细胞在48h的OD450值为0.360±0.056，显著低于卡铂处理下细胞的OD450值0.477±0.012（t=3.538，P=0.024）。以上结果表明，阿霉素处理下B-CPAP细胞的活力在华蟾素干预后显著降低。

表1 CCK-8检测华蟾素处理下化疗药物对甲状腺乳头状癌细胞处理后的吸光度值

表1 CCK-8检测华蟾素处理下化疗药物对甲状腺乳头状癌细胞处理后的吸光度值

组别OD450值（0h）OD450值（24h）OD450值（48h）OD450值（72h）对照组0.231±0.0190.314±0.0120.496±0.0350.837±0.038华蟾素组0.264±0.0310.274±0.0410.598±0.0510.899±0.042阿霉素组0.136±0.0120.261±0.0310.451±0.0470.753±0.053阿霉素+华蟾素组0.241±0.0170.237±0.0470.357±0.0180.555±0.041卡铂组0.249±0.0140.246±0.0230.477±0.0120.657±0.070卡铂+华蟾素组0.242±0.0160.267±0.0.350.360±0.0560.620±0.093

2.3 华蟾素对PTC细胞凋亡的影响华蟾素组B-CPAP细胞的凋亡率为（14.900±2.858）%，与对照组的细胞凋亡率（14.400± 0.755）%比较差异无统计学意义（t=0.2930，P=0.7841）；卡铂联合华蟾素组B-CPAP细胞的凋亡率为（23.800±1.375）%，与卡铂组的凋亡率（19.370±4.186）%相比差异无统计学意义（t=1.741，P=0.1566）；阿霉素联合华蟾素组B-CPAP细胞的凋亡率为（44.500±1.411）%与阿霉素组的凋亡率（35.470±2.139）%相比显著上升（t=6.104，P=0.0036）。见图3。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

3 讨论

肿瘤的发生与发展是一个受多因素共同影响的复杂过程，与原癌基因的激活，抑癌基因的失活，细胞增殖与凋亡的动态平衡被打破等多种生物过程相关。PTC的发生和发展也被证明与基因突变相关[5，6]。原癌基因BRAF在V600E位点的突变是PTC最常见的突变，占29%～83%[5]。BRAF蛋白是生长信号转导蛋白激酶RAF激酶家族的成员，参与调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性/细胞外信号调节激酶信号通路，促进细胞生长、分化和抗凋亡。BRAFV600E突变已被证明是一种有效的MAPK激活因子，在包括甲状腺癌在内的多种人类癌症中均有发生[7]。多项研究表明，BRAFV600E突变与甲状腺外扩张、多灶性、淋巴结转移、晚期TNM有关[8]，其不仅增加了肿瘤的侵袭性，而且增加了疾病的复发率和死亡率[9]。这些发现表明BRAFV600E突变型PTC需要更为前瞻性的手术治疗及更谨慎的后续观察治疗。

中药华蟾素具有抗癌、清热解毒、消肿、止痛、提高机体免疫力等功能，同时可刺激骨髓增生，增强机体对放疗、化疗的耐受性。中医角度解释其：“味辛、气凉、微毒，入心、肝、脾、肺四经”，具有利尿消肿、清热解毒、软坚散结的功效[10]。一项关于华蟾素联合化疗治疗晚期恶性肿瘤的临床研究结果表明，与单纯化疗相比，华蟾素联合治疗使治疗后骨髓抑制等并发症出现的概率显著降低，临床效果明显[11]。本研究中，20nM华蟾素对B-CPAP细胞的侵袭及迁移无显著影响，且单独使用华蟾素处理PTC细胞，其细胞活力也无明显变化；当华蟾素与阿霉素联合作用于B-CPAP细胞时，细胞活力与阿霉素单独处理时相比显著降低。除细胞活力受到抑制之外，华蟾素与阿霉素联合干预对B-CPAP细胞凋亡也具有显著影响，与阿霉素单独处理组相比，联合干预组的细胞凋亡率显著上升。以上结果表明，华蟾素使得B-CPAP细胞在阿霉素的处理下活力降低，凋亡增加，即增加了B-CPAP细胞的化疗敏感性。

本研究为中药华蟾素在BRAFV600E型PTC中的作用情况提供了实验基础，但其分子机制仍需进一步的探索，同时，本研究为今后华蟾素在BRAFV600E型PTC的临床治疗中提供了理论支持。