牺牲模板法中空硒化铜纳米材料的制备及表征

郭思男 冉瑞雪 王银松

天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室300070

0 引 言

中空铜基硫属纳米材料因其可调的物理化学性质、表面可修饰化、均匀性、单分散性和强大的载药能力，广泛应用于生物传感、成像、诊断和医疗、催化及药物递送等生物学领域[1-5]。与其他铜基纳米材料相比，中空硒化铜（Cu2-xSe）纳米材料不仅具有相似的物理化学性质，而且铜和硒均为人体中重要的微量元素[6-7]。中空Cu2-xSe的制备方法主要采用牺牲模板法，即先合成氧化亚铜（Cu2O）或氢氧化铜[Cu（OH）2]等前驱体，再以前驱体为牺牲模板，在硒离子溶液中根据Kirkendall效应制备出中空硒化铜结构[8-9]。相对于传统的硬模板法，牺牲模板法无需去除模板，可避免在去除模板过程中可能发生的壳层破裂问题[10]。Pang和Zeng[11]以Cu2O为牺牲模板，再与以硒粉和硼氢化钠（NaBH4）为原料配制的硒离子溶液进行反应，将Cu2O转化为中空CuSe纳米球。Wang等[12]亦以Cu2O为牺牲模板，再与以亚硫酸钠（Na2SO3）、硒粉和氢氧化钠（NaOH）为原料配制的硒离子溶液进行反应，将Cu2O转化为Cu2-xSe纳米立方盒。Zhou等[13]先采用铜箔氧化法制备Cu（OH）2纳米棒作为前驱体，再利用NaBH4和硒粉配制硒离子溶液，最后通过牺牲模板法将Cu（OH）2纳米棒转化为CuSe纳米管。然而目前这些研究主要集中于形貌方面，对粒径控制研究鲜有报道，且无相关文献研究溶液中的溶解氧对中空结构形成的影响。

本研究以聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）为包覆剂，水合肼为还原剂，异丙醇和水的混合溶剂为反应介质来制备Cu2O纳米粒子（Cu2O nanoparticles，Cu2ONPs），并通过改变反应溶剂的体积比制备不同尺寸的Cu2ONPs。再进一步以Cu2O为牺牲模板，以硒粉为硒源制备中空Cu2-xSe NPs，并探讨溶液中溶解氧对制备中空结构的影响。最后对中空Cu2-xSe NPs表面修饰甲氧基聚乙二醇巯基（methoxy polyethyleneglycol thiol，mPEG-SH），以提高纳米粒子稳定性，增强其生物相容性，并研究Cu2-xSe-PEGNPs的放射治疗（放疗）增敏和光热性能，以期为肿瘤的光热和放疗联合治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

PVPK30（上海胜沛新材料科技有限公司），二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）、异丙醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）（天津市科密欧化学试剂有限公司），硒粉、NaBH4（天津希恩思生化科技有限公司），NaOH（天津市化学试剂批发公司），水合肼（天津泰默生物科技有限公司）。

HT7700透射电子显微镜（日本Hitachi公司），Zetasizer Nano ZS激光粒度仪（英国Malvern公司），UV-1510紫外-可见分光光度计（美国Thermo Fisher Sientific公司），808 nm近红外激光器（长春镭仕光电科技有限公司），T640红外热成像仪（美国FLIR公司），RS2000生物学X射线辐照仪（美国Rad Source公司）。

1.2 方法

1.2.1 纳米粒子的制备

（一）Cu2ONPs的制备

在100 ml单颈圆底烧瓶中加入0.017 0 g CuCl2·2H2O和0.2 g PVP，然后加入不同体积比的异丙醇和超纯水（总体积为60 ml），常温700 r/min搅拌至完全溶解；逐滴加入600μl含0.008 0 g/ml NaOH的异丙醇溶液，700 r/min搅拌反应10 min；再逐滴加入600μl含0.008 0 g/ml NaOH的异丙醇溶液，继续搅拌反应10 min；缓慢加入200μl质量分数为35%的水合肼，继续搅拌反应10 min；反应结束后将产物离心（29 261×g，20 min），弃上清，即得Cu2O NPs。在本研究中将异丙醇和超纯水的体积比设置了3个比例，分别为59∶1、58.5∶1.5、58∶2，对应制得的纳米粒子分别定义为Cu2O NPs（59∶1）、Cu2ONPs（58.5∶1.5）和Cu2ONPs（58∶2）。

（二）Cu2-xSe NPs的制备

在100 ml三颈圆底烧瓶中加入0.010 0 g硒粉和19 ml超纯水，先通入惰性气体，在惰性气体保护下800 r/min搅拌5 min至完全溶解；再加入1 ml 0.0120g/ml NaBH4水溶液，继续在惰性气体保护下反应1 h；取2倍量Cu2ONPs（58∶2）溶于含有0.020 0 g PVP的10ml超纯水中，然后将其注入Se2-水溶液中，立即撤掉保护气体，暴露于空气中，700 r/min搅拌反应3 h；反应结束后将产物离心（29 261×g，20 min），弃上清，即得Cu2-xSe NPs，将其分散于7 ml无水乙醇中4℃保存。在本研究中使用的惰性气体分别为氩气（Ar）和氮气（N2），对应制得的纳米粒子分别定义为Cu2-xSe NPs（Ar）和Cu2-xSe NPs（N2）。

（三）Cu2-xSe-PEGNPs的制备

按照质量比Cu2-xSe∶mPEG-SH=1∶1.5将mPEGSH加入Cu2-xSe NPs（N2）水溶液中，600 r/min搅拌反应1 h。反应结束后将产物离心（29 261×g，20 min），弃上清，即得Cu2-xSe-PEGNPs，将其分散于超纯水中4℃保存。

1.2.2 纳米粒子的表征

分别取上述各步所得的Cu2ONPs和Cu2-xSe NPs分散液，滴于碳膜铜网上，自然晾干后于透射电子显微镜下观察。采用激光粒度仪检测各步所得的纳米粒子在溶液中的Zeta电位、粒径和粒径分布情况。采用紫外-可见分光光度计扫描Cu2-xSe NPs的紫外-可见吸收光谱图。

1.2.3 纳米粒子的光热性能考察

取Cu2-xSe-PEGNPs母液（4 mg/ml）加超纯水稀释配制成质量浓度分别为20、40、60、80、100、200和400μg/ml的Cu2-xSe-PEG NPs溶液，于激光器（808 nm，1.0 W/cm2）下照射10 min。在激光照射过程中全程用红外热成像仪录像，用软件IRBIS3 prof对录像结果进行统计分析。

1.2.4 纳米粒子的放疗增敏性能考察

取10μl荧光探针2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）溶液（20 mmol/L）加入1.6 ml NaOH溶液（10 mmol/L）中，避光搅拌反应30 min，再加入8.4 ml磷酸盐缓冲液（×1）稀释至20μmol/L备用。

（一）不同质量浓度的Cu2-xSe-PEGNPs经X射线照射后产生的活性氧水平

取Cu2-xSe-PEGNPs母液（4mg/ml）加超纯水稀释配制成质量浓度分别为40、60、80、100和200μg/ml的Cu2-xSe-PEGNPs溶液，各取500μl与上述500μl DCFH溶液混合，最终体系中Cu2-xSe-PEGNPs的质量浓度分别为20、40、60、80和100μg/ml。用X射线照射混合物，照射剂量为6 Gy，照射时间为300 s，之后于恒温振荡器中振荡1 h。采用荧光分光光度计测定DCF的荧光强度。

（二）不同剂量X射线照射下Cu2-xSe-PEGNPs产生的活性氧水平

取Cu2-xSe-PEGNPs母液（4 mg/ml）加超纯水稀释配制4份质量浓度为200μg/ml的Cu2-xSe-PEGNPs溶液，各取500μl与上述500μl DCFH溶液混合，最终体系中Cu2-xSe-PEGNPs的质量浓度为100μg/ml。用X射线照射混合物，照射剂量分别为4、6、8 Gy，照射时间为300 s，之后于恒温振荡器中振荡1 h。采用荧光分光光度计测定DCF的荧光强度。

2 结果

2.1 透射电子显微镜表征

采用透射电子显微镜对制备的各种Cu2ONPs和Cu2-xSe NPs进行了表征，结果见图1。由图1可看出合成的Cu2O NPs均为实心球形结构，粒径大小均一，且分散性良好；随着溶液中超纯水体积的增大，Cu2O NPs粒径从（31.5±8.9）nm增至（86.4±5.9）nm（图1A～1C）。由图1还可看出以Ar作保护气体时，合成的Cu2-xSe NPs的中空结构不明显（图1D），而以N2作保护气体时，中空结构很明显，空腔大至（45.8±9.6）nm，粒径大小均一，为（91.9±9.5）nm，分散性良好（图1E）。

图1 Cu2ONPs和Cu2-x Se NPs的透射电子显微镜图

2.2 粒径和电位表征

激光粒度仪测定结果如表1所示，Cu2O NPs、Cu2-xSe NPs和Cu2-xSe-PEGNPs的多分散系数均小于0.180，表明纳米粒子分散性良好。Cu2ONPs粒径为（96.3±4.3）nm，电位为（-9.3±0.6）mV；Cu2-xSe NPs粒径为（136.9±7.0）nm，电位为（-15.2±1.6）mV；Cu2-xSe-PEG NPs粒径为（161.5±6.4）nm，电位为（-22.1±1.3）mV。上述结果表明Cu2-xSe-PEGNPs合成成功。

表1 Cu2ONPs、Cu2-x Se NPs和Cu2-x Se-PEGNPs的粒径、多分散系数和Zeta电位（Mean±SD,n=3）

2.3 光学性质表征

如图2所示，Cu2-xSe NPs在近红外区（700～1 000 nm）有一定程度的吸收。

图2 Cu2-x Se纳米粒子的紫外-可见光图谱

2.4 光热性能考察

采用红外热成像仪记录808 nm激光照射下Cu2-xSe-PEGNPs在水中的升温过程，结果显示，随着Cu2-xSe-PEG NPs质量浓度的增加，温度也逐渐升高，表明其升温具有一定的浓度依赖性（图3A）；随着照射时间的延长，200μg/ml Cu2-xSe-PEGNPs溶液较H2O升温明显，10 min时温度超过55℃，表明Cu2-xSe-PEGNPs具有良好的光热性能（图3B）。

图3 Cu2-x Se-PEGNPs溶液经808 nm激光照射（1.0 W/cm2）10 min后的温度变化

2.5 放疗增敏性能考察

如图4所示，Cu2-xSe-PEGNPs经X射线辐照仪照射后，DCF荧光强度明显增强。随着Cu2-xSe-PEG NPs质量浓度的增加，DCF荧光强度随之增强，表明Cu2-xSe-PEGNPs产生活性氧的能力具有一定的浓度依赖性（图4A）；此外，随着照射剂量的增加，DCF荧光强度也随之增强，表明Cu2-xSe-PEGNPs产生活性氧的能力具有一定的放射剂量依赖性（图4B）。

图4 Cu2-x Se-PEGNPs溶液经X射线照射后产生的活性氧水平

3 讨论与结论

铜基硫属纳米材料由于具有光热和放疗增敏作用，已被发现可用于肿瘤的光热和放疗的协同治疗。Zhang等[14]在中空硫化铜上原位沉积Au，再包裹PEG得到了具有光热和放疗增敏功能的CuxS/Au-PEGNPs，该纳米粒子可用于肿瘤的第二窗口热疗和放疗，有效杀伤肿瘤组织。Huang等[15]在Cu2-xSe纳米颗粒基础上引入高原子序数元素Au，合成哑铃型异质结构的Cu2-xSe-Au纳米晶体，Cu2-xSe和Au具有光热和放疗的协同作用，可用于肿瘤的热放疗。

目前，中空Cu2-xSe NPs的制备方法已经得到了很大发展。中空结构的生长机制主要是基于Kirkendall效应、Ostwald熟化和化学自诱导转化这3种机制。其中基于Kirkendall效应的牺牲模板法被认为是制备中空纳米材料的最有效方法[11，16-18]。相对于传统的硬模板法，牺牲模板法的模板在反应过程中是一种反应前驱物，故所得产物无需经过高温煅烧或强酸强碱刻蚀等后处理过程即可得到中空结构的纳米材料。且由于所用模板大小均一，通过模板的控制诱导作用，一般可大面积地制备具有规整结构的中空材料[19-21]。本研究以Cu2O为模板剂和铜源，以硒粉为硒源，采用牺牲模板法制备得到了大小均一、分散良好的Cu2-xSe NPs。

本研究中在异丙醇和超纯水的混合溶剂中制备得到粒径在（96.3±4.3）nm的Cu2ONPs。在前期研究摸索中，笔者曾尝试单独使用超纯水作溶剂合成Cu2ONPs，结果发现无论怎样更改条件，所得纳米粒子的粒径均在200 nm以上；笔者亦曾尝试单独使用异丙醇作溶剂合成Cu2ONPs，结果发现所得纳米粒子的粒径过小，离心无法得到产物。这可能是由于在单独的超纯水相中，无机粒子之间的反应速度太快，无法合成较小的纳米粒子，而在单独的异丙醇溶剂中，黏度过大，无机粒子碰撞机会小，无法得到较大的纳米粒子。因此，本研究以异丙醇和超纯水的混合溶剂作为反应介质，经多次摸索发现将异丙醇和超纯水的体积比调整为58∶2时，所得Cu2ONPs粒径合适，形貌规则。在制备Cu2-xSe NPs的过程中，需在惰性气体保护下合成Se2-。若采用Ar作保护气体，得到的纳米粒子几乎无空心，而采用N2作保护气体则能得到具有较大空腔结构的Cu2-xSe NPs。有研究结果表明，Cu2O并非直接形成Cu2-xSe，而是在溶液中溶解氧的作用下Cu2O表面先形成一层CuO薄层，然后再与Se2-作用形成Cu2-xSe[8，11]。若采用密度比空气大很多的Ar作保护气体，即使在加入Cu2O的那一刻撤掉Ar，空气也无法进入溶液中，导致无溶解氧，Se2-无法蚀刻Cu2O模板，故应采用密度较小的N2作为保护气体。

本研究提供了一种基于牺牲模板法合成中空Cu2-xSe NPs的温和方法，能获得粒径可控的Cu2-xSe NPs。重要的是，Cu2-xSe-PEGNPs同时具有光热和放疗增敏性能，这为Cu2-xSe-PEGNPs用于肿瘤的热放疗提供了一定的理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突