线粒体损伤和凋亡在鱼藤素致16HBE细胞毒性中的作用*

方琼彤，吕满霞，吴新荣

(1.中山大学附属第五医院药学部，珠海 519000；2.中国人民解放军南部战区总医院药学部，广州 510010；3.中新国际联合研究院，广州 510700)

鱼藤素(deguelin)作为热休克蛋白90特异性抑制剂[1-2]，可对多种致癌途径和炎性途径产生影响，是治疗不同恶性肿瘤的潜在活性物质。研究表明，鱼藤素主要通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B[phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) /protein kinase B (AKT) ，PI3K/AKT]信号通路介导凋亡、周期阻滞和抑制血管生成，对非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌、淋巴癌及结肠癌等多种肿瘤具有显著抑制活性[3]。CABONI等[4]发现高浓度鱼藤素作用后，大鼠阳性神经元酪氨酸羟化酶活性减弱，引发行为异常，产生类帕金森综合征；LEE和KIM等[5-7]发现，鱼藤素对神经细胞、支气管上皮细胞有较明显毒性。有学者对鱼藤素进行结构改造，选用神经细胞和支气管上皮细胞株判断其结构改造后细胞毒性，但其中潜在的作用机制仍未阐明。笔者所在课题组前期对鱼藤素神经毒性研究较多[8-9]，对鱼藤素肺毒性研究较少，因此笔者以人支气管上皮样细胞(human bronchial epithelial cells，16HBE ) 为研究对象，观察线粒体和细胞核结构，测定相关酶活力、膜电位和凋亡率，初步探究鱼藤素致16HBE细胞毒性的机制，以期为缓解该药的毒副作用、将该药改造为高效低毒的化合物提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞株 16HBE由中国人民解放军南部战区总医院医学实验科提供。

1.2试剂 鱼藤素(美国Sigma公司，含量>98%，批号：D0817)、二甲亚砜(DMSO，美国Sigma公司，批号：RNBD6895)；Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)高糖培养基(美国Gibco公司，批号：11965-118)；胎牛血清(美国Gibco公司，批号：10099-141)；罗丹明123(美国Sigma公司，批号：R8004)；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒 (日本同仁化学研究，批号：CK04)；磷脂酰丝氨酸蛋白V/碘化丙啶 (Annexin V-FITC/PI) 细胞凋亡检测试剂盒(日本同仁化学研究，批号：C1065-2)；赫斯特33342染料(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGA212-1)；线粒体绿色荧光探针(批号：C1048)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)检测试剂盒(批号：S0056)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(批号：S0101)均购自碧云天生物技术有限公司。

1.3仪器 水套式二氧化碳(CO2)细胞培养箱(美国Thermo公司，型号：3111 )，台式离心机(KUBOTA公司，型号：G41054-F000，r=16 cm)，倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司，型号：IX7)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司，型号：HWS28)，全波长酶标仪(美国Thermo公司，型号：Multiscan-GO)，低温高速离心机(美国Thermo公司，型号：RRESCO 17，r=3 cm)，流式细胞仪 (美国 BD 生物科技公司，型号：BD LSRFortessa)，透射电镜(日本HITACHI公司，型号：H-7650)。

1.4鱼藤素的配制 100 mmol·L-1鱼藤素母液的配制：将鱼藤素50 mg溶于DMSO溶液1.27 mL，置于-20 ℃低温避光保存。

1.5细胞的培养 从液氮罐取出16HBE细胞，37 ℃水浴复苏，1 min内完成，并在超净工作台将细胞转移至离心管，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基1 mL，1000 r·min-1离心5 min(r=16 cm) ，去掉上层旧液后加入新鲜培养基，37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.6细胞增殖毒性测定 取对数生长期细胞，按照8×108·L-1密度接种于96孔板，每孔接种细胞液100 μL，将细胞分为8组，每组3个复孔，置37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养，使细胞贴壁生长。次日去除旧培养基，对照组加入不含药液的DMEM高糖培养基100 μL，其他实验组加入1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μmol·L-1鱼藤素各100 μL，作用24 h后加入培养基与细胞计数(cell counting kit-8，CCK-8)试剂(9：1)混合液，每孔100 μL，培养箱孵育2 h，酶标仪上450 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞抑制率(%)=[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100%。平行3次，计算得细胞抑制率和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.7线粒体绿色荧光探针和Hoechst 33342双染色 取对数生长期细胞，密度1.2×108·L-1，每孔接种2 mL，均匀分布。恒温培养箱培养24 h，细胞贴壁。根据细胞毒性实验IC50确定中剂量，并因此推断出小、大剂量，每组3个复孔。实验分为4组：A组为对照组，每个复孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基2 mL；B组为鱼藤素小剂量组，每个复孔加入15 μmol·L-1鱼藤素2 mL；C组为鱼藤素中剂量组，每个复孔加入30 μmol·L-1鱼藤素2 mL；D组为鱼藤素大剂量组，每个复孔加入60 μmol·L-1鱼藤素2 mL。孵育24 h后，PBS洗涤孔板内细胞2次。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配制1 μmol·L-1线粒体绿色荧光探针染液与细胞共孵育30 min，常温PBS缓冲液洗涤细胞2次，吸干后加入PBS配制的1 μmol·L-1Hoechst 33342核染液，与细胞共孵育10 min，PBS缓冲液洗涤2次，倒置荧光显微镜观察。

1.8线粒体和细胞核超微结构观察 取对数生长期细胞，密度3×108·L-1，按每皿8 mL接种，均匀分布。恒温培养箱培养24 h，使细胞贴壁，设置A、B、C和D组等干预组，处理细胞24 h，收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min(r=16 cm)，除去上清液，沿壁缓慢加入2.5%戊二醛，置于4 ℃冰箱固定2 h。用0.1 mol·L-1PBS漂洗20 min，3次，2%锇酸固定液固定 1.5 h。按透射电镜实验要求制作样品，包埋，聚合，用Leica 热膨胀式超薄切片机切片，厚度60 nm。切完的超薄切片放到铜网(乙醇清洗，覆盖1% Formar膜)上，经枸橼酸铅双染色后放入电镜内观察，在10 000倍下观察，随机摄影记录细胞线粒体和细胞核微观结构。

1.9GPx与SOD酶活力测定 取对数生长期细胞，密度1.2×108·L-1，每孔2 mL接种，均匀分布。恒温培养箱培养24 h，使细胞贴壁。实验分组同“1.7”项，各组干预24 h后，PBS洗涤2次。取细胞裂解液100 μL吹打裂解细胞15～20 min，裂解完毕将裂解液收集于离心管(eppendorf，EP)，12 000 r·min-1离心10 min(r=3 cm)，取上清液，按照SOD与GPx试剂盒操作说明进行检测和计算。

1.10细胞MMP水平检测 取对数生长期细胞，密度1.2×108·L-1，每孔接种2 mL，均匀分布。恒温培养箱培养24 h，使细胞贴壁。实验分组同“1.7”项，24 h后收集细胞，1000 r·min-1离心5 min(r=3 cm)，去除上清液。无血清培养基配制4 μmol·L-1罗丹明123染液，每个样品用染液1 mL重悬细胞，37 ℃避光孵育，每隔5 min振荡1次，共30 min。1000 r·min-1离心5 min(r=16 cm)后，PBS洗涤并重悬细胞，流式细胞仪检测各组样品荧光强度。

1.11细胞凋亡率检测 取对数生长期细胞，密度1.2×108·L-1，每孔接种2 mL，均匀分布。恒温培养箱培养24 h，使细胞贴壁。实验分组同“1.7”项，24 h后收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min(r=3 cm)，弃去上清液。PBS轻轻洗涤2次，加入4 ℃预冷的PBS 500 μL重悬细胞，将细胞吹匀后转移至2 mL EP管。每组细胞加Annexin V-FITC溶液和PI溶液各5 μL，吹打混匀，避光孵育15～20 min，随后转移至流式管，测定细胞凋亡率。

2 结果

2.116HBE细胞增殖情况 各组细胞存活率测定结果见图1。随着鱼藤素浓度的增加，16HBE细胞存活率显著下降。与对照组比较，鱼藤素各浓度组细胞存活率显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。鱼藤素作用16HBE细胞24，48和72 h的IC50分别为(32.95±2.39)，(21.07±2.21)和(15.46±0.93)μmol·L-1。实验结果表明，鱼藤素对16HBE细胞增殖有显著抑制作用，且呈现时间和浓度依赖性。

①与对照组比较，P<0.05。图1 不同浓度鱼藤素对16HBE细胞不同时间生长抑制率的影响①Compared with control group，P<0.05.Fig.1 Effects of deguelin at different concentrations on the inhibitory rate of 16HBE cells at different time

2.216HBE细胞线粒体与核形态 结果见图2。对照组细胞密集，核外线粒体均匀分布，线粒体绿色荧光明显；细胞核均呈淡蓝色，无亮蓝色荧光出现，细胞核无受损。在各剂量鱼藤素组中，随着鱼藤素浓度增加亮蓝色荧光明显增强，绿色荧光逐渐减少。鱼藤素大剂量组细胞线粒体绿色荧光标记非常少，细胞核出现大部分亮蓝色荧光，细胞皱缩。提示在大剂量鱼藤素作用下，16HBE细胞线粒体和细胞核受损严重。

图2 4组16HBE细胞荧光染色图Fig.2 Fluorescence staining on four groups of 16HBE cells

2.316HBE细胞线粒体与细胞核微观结构 结果见图3。对照组细胞核核仁紧密，鱼藤素中剂量组细胞核异染色体聚集向四周扩散，核边缘出现聚集的异染色体。对照组线粒体嵴完好明显，呈短棒状或长棒状，鱼藤素各剂量组细胞内线粒体肿胀，空泡化甚至嵴脱落。提示鱼藤素对16HBE细胞的损伤与细胞核和线粒体形态改变有关。

2.416HBE细胞中MMP水平测定结果 结果见图4。对照组荧光强度57 682±719.1；空白组荧光强度(81±5.70)；15，30，60 μmol·L-1鱼藤素组荧光强度分别为(51 593±1 525.4)，(29 427±578.4)和(23 575±1 366.8)。与对照组比较，15，30，60 μmol·L-1鱼藤素组细胞荧光强度均显著下降(P<0.05)，提示鱼藤素对16HBE细胞的损伤可能与膜电位水平下降有关，且该损伤呈浓度依赖性。

图 3 2组16HBE细胞电镜形态图Fig.3 Morphology of two groups of 16HBE cells detected by transmission electron microscope

图4 5组16HBE细胞膜电位水平测定结果Fig 4 Results of MMP in five groups of 16HBE cells

2.516HBE细胞GPx与SOD酶活力 细胞中SOD与GPx活力测定结果见图5。与对照组比较，鱼藤素各剂量组16HBE细胞内SOD和GPx活力下降，且随着鱼藤素浓度增加而下降(P<0.05)。表明鱼藤素对16HBE细胞损伤伴随着线粒体抗氧化酶系活力减弱。

2.616HBE细胞凋亡率 Annexin-V FITC/PI 双染结果见图6，细胞凋亡率测定结果见表1。与对照组比较，鱼藤素各剂量组早期凋亡和晚期凋亡细胞以及总凋亡细胞显著增多(P<0.05)，且随着鱼藤素浓度增加更加明显。说明鱼藤素能诱导16HBE细胞凋亡，且呈浓度依赖性。

表1 4组16HBE细胞凋亡率测定结果Tab.1 Results of apoptosis rate in four groups of 16HBE cells

图6 4组16HBE细胞Annexin-V FITC/PI 双染细胞凋亡图Fig 6 Apoptosis image of four groups of 16HBE cells detected by Annexin-V FITC/PI

3 讨论

大量研究表明，鱼藤素具有潜在抗肿瘤活性，但由于其较大的神经毒性、肺毒性和眼毒性[5]，阻碍了其成为抗肿瘤药物。鱼藤素对癌前和恶化的支气管上皮细胞有着突出的抑制活性，但对正常支气管上皮细胞有毒性作用[7]。笔者所见鱼藤素所致肺毒性研究较少，其中潜在机制亦未阐明。笔者选用支气管上皮细胞16HBE作为研究对象，通过CCK-8法测定其IC50值从而确定后续实验的中剂量组，进而设置不同剂量梯度的鱼藤素作用组和对照组作进一步研究。

线粒体作为为真核细胞供能的关键细胞器，通过参与能量代谢、活性氧(reactive oxygen species，ROS) 产生、钙稳态、应激反应和程序性细胞死亡决定细胞存活或死亡[10-11]。许多实验和临床研究证明，在致病性条件下，心脏、骨骼肌和大脑等组织中线粒体的形态和数量发生明显变化[12-13]。同时，线粒体损伤还与线粒体的生物合成、基因调控、膜电位以及相关抗氧化酶系的活力变化有关[14-16]。通过对相关的指标测定，可以初步探究细胞毒性与线粒体损伤的关系。MMP是最常见反映线粒体通透性的指标之一，MMP丧失是细胞凋亡发生的必然途径。笔者在本实验通过透射电镜观察细胞线粒体和细胞核超微观结构，发现30 μmol·L-1鱼藤素处理后，细胞线粒体明显肿胀，嵴丢失和空泡化，细胞核异染色质聚集。线粒体绿色荧光探针和Hoechst 33342双染色中，随着鱼藤素浓度增高，16HBE细胞的细胞核出现亮蓝色程度变大，说明其凋亡更加明显，线粒体绿色荧光逐渐下降，预示着活细胞线粒体减少。笔者还发现，随着鱼藤素浓度增加，细胞MMP逐渐下降，凋亡率显著上升。研究表明，线粒体损伤和细胞凋亡可能在鱼藤素致16HBE细胞毒性中起重要作用。

线粒体损伤会对机体氧化应激水平作出正向反馈，使得机体氧化应激水平剧增[17]。笔者在本研究测定氧化应激相关酶SOD和GPx。SOD和GPx能够清除活细胞内过氧化物，测定细胞中抗氧化酶活力可以了解细胞损伤情况。研究发现，鱼藤素干预后细胞内抗氧化酶水平下降，且随着鱼藤素浓度增加下降更明显，提示鱼藤素使16HBE细胞抵御外界损伤能力减弱。

线粒体损伤被认为是机体各种病理状态发生的重要因素，细胞线粒体膜上有丰富的Caspase家族因子、Bax家族因子，以及细胞色素C等相关因子，能对外界损伤作出反应，介导细胞凋亡[17-18]。后续需要在基因和蛋白表达层面深入探索鱼藤素导致16HBE细胞线粒体损伤的主要介导通路，并尝试通过基因敲除或者应用抑制剂，减轻鱼藤素的毒副作用。

综上所述，鱼藤素致16HBE支气管上皮细胞毒性机制可能通过损伤线粒体，使线粒体和细胞核形态出现异常，降低MMP，降低细胞内抗氧化酶SOD和GPx的活力，导致细胞凋亡。本实验通过研究线粒体损伤与细胞毒性相关性，可为降低鱼藤素毒性提供参考。

志谢：本实验在中国人民解放军南部战区总医院医学实验科完成，特别感谢医学实验科各实验室老师的指导和帮助！