miR-99a-3p靶向调控CD36基因对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响及其机制

刘倩 白建民

(南阳医学高等专科学校护理系，河南 南阳 473000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的并发症之一，也是糖尿病患者死亡的重要原因之一，临床上其主要病理特征之一为肾小球足细胞损伤，在DN的发生、发展中有重要作用〔1〕。miRNA在肾脏发育、平衡和疾病中具有重要作用，与肾小管间质硬化和终末期肾小球病变的发生相关；可作为肾病的一种新的诊断标志物和治疗靶点〔2〕。miR-99a通过靶向骨形态发生蛋白受体(BMPR)2基因可调节大鼠间充质干细胞的早期软骨形成分化〔3〕；miR-99a-3p的异位表达能显著抑制癌细胞在前列腺癌(PCa)细胞中的增殖、迁移和侵袭〔4〕。分化抗原(CD)36是清道夫受体家族成员之一，是巨噬细胞吞噬脂质的主要受体，与多种配体相结合可介导先天性免疫及炎症等〔5〕。CD36在乙酰氨基酚诱导的肝损伤中通过促进肝脏炎性反应及促进细胞凋亡发挥促进炎症应答的作用〔6〕；CD36也与2型糖尿病的发病有关，高糖环境可上调CD36的表达，CD36单核苷酸多态性与胰岛素抵抗密切相关〔7〕。但miR-99a-3p在高糖诱导的小鼠足细胞损伤中的表达及其对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响，且是否靶向调控CD36目前还尚未可知。本研究旨在研究miR-99a-3p是否通过靶向调控CD36影响高糖诱导的小鼠足细胞损伤。

1 材料与方法

1.1材料 鼠肾脏足细胞系MPC5购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、DMEM-F12培养基购自美国Sigma公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 将小鼠足细胞在DMEM-F12完全培养液中培养，平均3～4 d达80%以上融合传代；平均10～14 d分化成熟后，饥饿培养24 h，用终浓度为30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激细胞作为高糖(HG)组，同时以终浓度为5 mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞作为正常对照(NG)组。将miR-NC、miR-99a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-99a-3p分别转染至未经任何处理的小鼠足细胞中，记为miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组。将miR-NC、miR-99a-3p、si-NC、si-CD36转染至高糖处理的小鼠足细胞中，记为HG+miR-NC组、HG+miR-99a-3p组、HG+si-NC组和HG+si-CD36组。将miR-99a-3p与pcDNA、pcDNA-CD36分别共同转染至高糖处理的小鼠足细胞中，记为HG+miR-99a-3p+pcDNA组、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36组。

1.2.2qRT-PCR检测miR-99a-3p和CD36 mRNA的表达水平 收集各组细胞，提取总RNA后反转录成cDNA，按试剂盒说明进行PCR扩增，循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.3Western印迹检测蛋白表达 提取细胞总蛋白后用BCA试剂盒进行定量，将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脱脂奶粉封闭后加入一抗4℃孵育过夜；再加入二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，分析蛋白条带吸光度，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，漂洗后用结合缓冲液重悬，然后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育；上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5荧光素酶报告基因检测实验检测miR-99a-3p对CD36的靶向调控 构建野生型和突变型基因靶点CD36的3′UTR荧光素酶载体(WT-CD36和MUT-CD36)，将其分别与miR-NC和miR-99a-3p转染至小鼠足细胞中，按试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1高糖诱导对小鼠足细胞中miR-99a-3p和CD36表达的影响 与NG组相比，HG组小鼠足细胞中miR-99a-3p的表达水平显著降低；CD36 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)，见图1，表1。可见，高糖诱导促进小鼠足细胞中CD36的表达，抑制miR-99a-3p的表达。

表1 高糖诱导对小鼠足细胞中miR-99a-3p和CD36表达的影响

图1 CD36蛋白表达

2.2miR-99a-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞中podocin及nephrin蛋白表达的影响 与HG+miR-NC组相比，HG+miR-99a-3p组小鼠足细胞中miR-99a-3p的表达水平显著升高，podocin、nephrin蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。见图2，表2。

1～4：NG组、HG组、HG+miR+NC组、HG+miR-99a-3p组；图3同图2 podocin和nephrin蛋白表达

表2 miR-99a-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞中podocin、nephrin蛋白表达及凋亡率和凋亡相关蛋白表达的影响

2.3miR-99a-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 与NG组相比，HG组小鼠足细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与HG+miR-NC组相比，HG+miR-99a-3p组小鼠足细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达水平显著降低，小鼠足细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见表2、图3、图4。

图3 细胞凋亡流式图

图4 凋亡相关蛋白表达

2.4抑制CD36表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响 与HG+si-NC组相比，HG+si-CD36组小鼠足细胞中podocin、nephrin、Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，CD36、Bax蛋白的表达水平显著降低，小鼠足细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)。图5，表3。

表3 抑制CD36表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响

图5 CD36、podocin、nephrin和凋亡相关蛋白表达

2.5miR-99a-3p靶向调控CD36的表达 TargetScan预测显示CD36与miR-99a-3p存在结合位点(图6)。荧光素酶报告基因检测结果(表4)显示，转染miR-99a-3p和WT-CD36后的小鼠足细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染miR-99a-3p和MUT-CD36后的小鼠足细胞荧光素酶活性差异不显著。miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组CD36蛋白表达分别为：0.52±0.05、0.23±0.02、0.49±0.05、0.92±0.08。过表达miR-99a-3p，CD36蛋白的表达水平降低；抑制miR-99a-3p表达，CD36蛋白的表达水平升高(P<0.05，n=6)。见图7。

表4 双荧光素酶报告实验

图6 CD36的3′UTR中含有与miR-99a-3p互补的核苷酸序列

1～4:miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组图7 miR-99a-3p靶向调控CD36的表达

2.6CD36过表达逆转了miR-99a-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用 与HG+miR-99a-3p+pcDNA组相比，HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36组小鼠足细胞中podocin、nephrin、Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，CD36、Bax蛋白的表达水平显著升高，小鼠足细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)。见图8、表5。

1～4：HG+miR-NC组、HG+miR-99a-3p组、HG+miR-99a-3p+pcDNA组、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36组图8 CD36、podocin、nephrin和凋亡相关蛋白表达

表5 CD36过表达逆转了miR-99a-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用

3 讨 论

足细胞损伤是糖尿病肾病DN进展的关键，随着糖尿病肾病的进展，损伤积累可导致足细胞凋亡与脱落、肾小球基底膜破坏等〔8〕。因此，研究足细胞损伤机制，有助于糖尿病肾病的治疗。研究发现miRNA在糖尿病及其并发症的病理发生发展中具有重要调节作用〔9〕。miR-99a过表达可以减弱脑缺血再灌注诱导的小鼠脑组织损伤和神经功能缺损〔10〕。miR-99a通过激活H9c2细胞中的Notch途径可减少脂多糖诱导的氧化损伤〔11〕。miR-99a-3p可预测晚期结直肠癌患者的化疗反应〔12〕。miR-99a对过氧化氢诱导的神经细胞氧化损伤具有保护作用〔13〕。脂多糖可明显抑制内皮细胞中miR-99a的表达，过表达miR-99a抑制脂多糖导致的炎性因子表达升高，miR-99a对脂多糖损伤的内皮细胞具有保护作用〔14〕。本实验结果发现在高糖诱导的小鼠足细胞中miR-99a-3p低表达，过表达miR-99a-3p表达可保护高糖刺激的小鼠足细胞损伤，且miR-99a-3p可靶向调控CD36的表达。

研究发现糖尿病大鼠巨噬细胞中CD36的表达水平升高，CD36参与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展〔15〕。CD36参与高脂介导的足细胞凋亡，是脂代谢紊乱肾损害的重要机制之一〔16〕。CD36通过氧化应激介导脂肪酸诱导的足细胞凋亡，可能参与糖尿病肾病的过程〔17〕。CD36在糖尿病肾病中高表达，高糖能抑制人肾小管上皮细胞的增殖，促进细胞凋亡，而沉默CD36的表达可通过调控Wnt/β-catenin信号通路减弱高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡〔18〕。在近端肾小管上皮细胞中，CD36介导近端肾小管上皮细胞的凋亡而导致糖尿病肾病的发生发展〔19〕。炎症应激状态下肾脏CD36表达升高，肾功能损害明显，CD36缺失或被抑制可以改善炎症应激导致的肾损害〔20〕。本实验结果显示在高糖诱导的小鼠足细胞中CD36高表达，抑制表达CD36可保护高糖刺激的小鼠足细胞损伤，且过表达CD36能逆转miR-99a-3p过表达对高糖刺激小鼠足细胞损伤的保护作用。

综上所述，miR-99a-3p可能通过下调CD36表达对高糖刺激的小鼠足细胞损伤有保护作用。