循环水养殖系统微滤机过滤对调节水体细菌群落结构的影响

肖 坤，郝婧薇，王 艺，曲宝成，傅松哲，刘 鹰

(1 大连海洋大学水产设施养殖与装备工程技术研究中心，辽宁 大连，116023；2 设施渔业教育部重点实验室，辽宁 大连，116023;3 河北科技师范学院 海洋资源与环境学院，河北 秦皇岛，066000)

循环水养殖系统(Recirculating aquaculture system，RAS)因其节水、高效、环保和产品安全被普遍认为是解决水产养殖环境污染、提高产品质量、实现可持续发展的有效途径[1-4]。然而由于养殖过程中饲料投喂和粪便产生等原因，养殖水体中存在相当数量(3～25 mg/L)的总固体悬浮物(Total suspended solids，TSS)。固体悬浮物包括无机和有机两种，其中有机固体悬浮物会导致氧的消耗、有机物腐败和病原菌滋生等问题，而无机固体悬浮物极易堵塞养殖生物的鳃，吸附于悬浮物的大量病原微生物很容易造成宿主的鳃部感染，这些都大大增大了养殖生物的发病概率[5-8]。因此，如何降低循环水养殖系统的悬浮颗粒物质量浓度，减少病害发生的潜在风险，是实现循环水养殖新模式稳定运行的关键[9]。

许多研究已表明过滤可以有效降低养殖水体致病菌含量。Huq等[10]于1996年使用家用纱丽材料制作的滤器对含有霍乱弧菌的水源进行过滤试验，结果表明过滤能够去除水体中99 %的霍乱弧菌，可以有效地阻止霍乱的传播。Fu等[11]将27种常见海洋细菌引入养殖鲈鱼的循环水养殖系统，之后通过20 μm的尼龙网或4层纱丽网对养殖水体进行过滤，结果表明过滤可以去除养殖水体90 %的弧菌，过滤后养殖池鲈鱼的死亡率显著低于未过滤养殖池。

循环水养殖系统中，微滤机在去除固体悬浮物上起着重要作用[12-14]。然而，微滤机在多大程度上能够调节养殖水体中细菌种群组成的相关研究还未见报道。特别是长时间运行后，微滤机处理效果的相关研究较少。

采用FISH检测和16S rDNA扩增子测序技术识别和表征无微滤机的池A及微滤机过滤的池B养殖水体中细菌种群结构的变化，旨在为微滤机过滤对循环水养殖水体细菌种群结构的影响进行探究，为循环水养殖生产中病害的防控提供指导。

1 材料和方法

1.1 循环水养殖试验系统

以大连海洋大学设施养殖与装备工程研究中心实验室内养殖红鳍东方鲀(Takifugurubripes)的循环水试验系统进行试验，每套系统均由相同规格的养殖池、微滤机、蛋白分离器、生物处理系统、臭氧泵和紫外消毒装置组成。养殖池规格为100 cm×80 cm×130 cm，两套系统分别编号A和B，A系统无微滤机，表示为“池A”，而B系统安装200目滤网直径(约74 μm)的微滤机，表示为“池B”。在保持5%日补充新水量的情况下维持60 d。试验用鱼为红鳍东方鲀幼鱼(15.27 g/尾)，每个养殖池投放20尾，初始养殖密度2.55 kg/m3。系统的生物滤池均挂膜30 d后开始进行试验。养殖试验中控制养殖水体DO 7～8 mg/L，pH 7.0～7.2，温度(T)18～23 ℃，盐度为30～32，水力停留时间(HRT)约为30 min。

1.2 循环水养殖系统水样采集与处理

自2018年6月29日开始养殖，在试验第1天，第30天，第60天后分别于A和B养殖池水面以下0.1 m处采集水样1.5 L，其中0.5 L用于水样弧菌计数、异养细菌计数和FISH检测，1 L用于养殖水体总基因组DNA的提取。所有样品采集后立即在实验室进行以下处理：1)弧菌和异养细菌计数：取水样2 mL后混匀备用。2)FISH检测水样制备：取100 mL养殖水体室温下以甲醛(最终浓度，质量/体积为2%)固定30 min后，于0.22 μm无菌醋酸纤维滤器过滤收集，双蒸水冲洗过滤器收集样品后于-20 ℃储存备用。3)提取总基因组DNA水样制备：参照吴欢欢等[15]的方法，养殖水体以置有 0.22 μm 无菌醋酸纤维素酯膜的滤器进行抽滤，之后将滤膜剪碎装于无菌离心管中，以水样微生物总 DNA 提取试剂盒(FOREGENE)对养殖水体细菌进行基因组DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA提取质量，-20 ℃储存备用。

1.3 循环水养殖系统水体弧菌和异养细菌计数

取养殖水体1 mL做10倍系列梯度稀释液分别涂布于TCBS和LB平皿内，每个稀释梯度设置3个平行，于37 ℃培养48 h后进行计数[16]。

1.4 循环水养殖系统水体细菌FISH检测

筛选典型的r-策略菌群的弧菌属(Vibrio)、k-策略菌群的红细菌科(Rhodobacteraceae)的红细菌属(Rhodobacter)和玫瑰杆菌属(Roseolacter)为检测菌，利用Eilers等[17]设计的特异性寡核苷酸探针G-V(5’-AGGCCACAACCTCCAAGTAG-3’)和G-Rb(5’-GTCAGTATCGAGCCAGTGAG-3’)对养殖水体的r-策略菌群和k-策略菌群空间的分布变化进行FISH检测。

FISH检测以Eilers等[17]方法按以下步骤进行：1)将固定的水体样本转移至涂有聚四氟乙烯的显微镜载玻片上，通过空气干燥进行固定；2)将已干燥固定样本依次以50%，80%和100%(wt/vol)乙醇进行脱水和进一步固定；3)脱水后将载玻片上的细胞与寡核苷酸探针G-V和G-Rb杂交；4)对杂交后的样本进行4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；1 mg/mL)染色；5)将制备好的样品置于显微镜下观察。

1.5 16S rDNA文库的构建

提取养殖水体总基因组DNA，委托北京百迈克科技股份有限公司进行16S rDNA V4区高通量测序及16S rDNA文库的构建。基于 Illumina HiSeq 测序平台，以双末端测序(Paired-End)进行小片段文库的构建，构建后对文库进行测序，每个样品重复2次。在对原始测序序列进行过滤、双端拼接后得到优化序列。利用软件QIIME(version 1.8.0)[18]中的UCLUST将优化序列进行聚类，进而进行操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)的划分，并根据OTU的序列组成获得养殖水体样本中细菌的物种分类。在OTU结果的基础上对样品进行分类学分析，获得养殖水体细菌的群落结构图。Alpha多样性分析研究97%以上相似度水平下的Ace、Chao1及Shannon指数，对养殖水体细菌群落多样性进行分析。同时运用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)技术对养殖水体细菌群落的差异性进行分析。

1.6 数据分析

数据采用SPSS 20.0统计学软件对养殖水体弧菌和细菌总数进行配对样本T检验。

2 结果

2.1 循环水养殖系统水体弧菌和异养细菌总数的变化

在养殖试验周期内，循环水养殖系统运行正常，红鳍东方鲀幼鱼均未出现死亡且摄食与活动均较为正常。

养殖水体中弧菌总数如图1所示，随着时间的推移，养殖水体弧菌总数迅速升高，池A养殖水体弧菌总数均高于池B，尤其是第60天时，池A养殖水体弧菌总数显著高于池B(P<0.05)。

图1 循环水养殖系统水体弧菌总数变化

养殖水体中异养细菌总数如图2所示，随着时间的推移，养殖水体异养细菌总数亦迅速升高，

图2 循环水养殖系统水体异养细菌总数变化

除试验第1天外，池A养殖水体异养细菌总数均高于池B，第60天时，池A养殖水体异养细菌总数显著高于池B(P<0.05)。

2.2 循环水养殖系统的水体细菌空间分布变化

结果如图3所示，养殖起始时，池A和池B养殖水体FISH检测弧菌属与红细菌科信号的强度和数量相近且分布较为均匀。随着时间的推移，检测荧光信号强度及数量均逐步增加，表明检测菌数量逐步增多。池A如图3A所示，随时间的推移，养殖水体中检测弧菌属荧光信号聚集成点状，而检测红细菌科的荧光信号较均匀地分布于养殖水体中；池B如图3B所示，随时间的推移，养殖水体中检测弧菌属与红细菌科荧光信号明显增加的同时，依然较均匀地分布于养殖水体中。

图3 循环水养殖系统水体细菌FISH检测

2.3 16S rDNA扩增测序

2.3.1 循环水养殖系统水体细菌群落组成分析

对养殖水体各采样点水体进行16S rDNA V4扩增测序，池A 3个采样时间的水体分别标记为1 A，30 A和60 A，池B 3个采样时间的水体分别标记为1 B、30 B和60 B。

样品的覆盖率(Good’s coverage)指数均达到99.9 %(表1)，说明本试验测序深度足够大，足以覆盖样品的大多数微生物，测序的数据量合理[19]。对OTUs的代表序列进行物种注释，结果显示循环水系统水体中细菌主要分布于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)和α-变形菌纲(α-Proteobacteria)。其中，除1B养殖水体优势菌为Cobetia属外，其他养殖水体优势菌均为弧菌属、Erythrobacter属和红细菌科(Rhodobacteraceae)。池A和池B养殖水体细菌组成结构存在一定差异，采集的养殖水体中，池A养殖水体中弧菌属所占总细菌的比例随时间的推移迅速升高，池B养殖水体中弧菌属所占总细菌的比例在试验第1天和第30天时均较小，在第60天时迅速升高。两池相较而言，池A水体中的弧菌属所占细菌总量的比例均显著高于池B；除试验第30天存在波动外，池A水体中具有较好调水作用的红细菌科所占细菌总量的比例显著低于池B(图4)。

图4 循环水养殖系统水体细菌种群结构组成

2.3.2 循环水养殖系统水体的细菌群落多样性分析

对养殖水体细菌群落的Alpha多样性(Alpha diversity)进行分析，反映养殖水体细菌群落物种丰度及多样性。结果显示：试验第1天，池A养殖水体细菌种群Chao1指数和Ace指数显著低于池B，其他时间点池A和池B养殖水体Chao1指数、Ace指数及Shannon指数均无明显变化，即表明试验第1天，池A养殖水体的细菌丰度和多样性均高于池B，而其他时间池A与池B养殖水体的细菌丰度和多样性无显著变化(表1)。

表1 样品的细菌群落多样性

2.3.3 循环水养殖系统水体细菌群落相似性分析

对池A和池B养殖水体细菌群落的测序结果进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)。PC1和PC2解释了养殖水体中细菌群落 63.10%和 26.85%的信息，两主成分之和大于89%，较好地代表了样品中的细菌群落信息。分析结果显示：除试验第1天外，池A与池B距离较远，即表明除试验第1天外，池A和池B养殖水体的细菌群落组成均存在较大差异(图5)。

图5 循环水养殖系统水体细菌主成分分析

3 讨论

3.1 微滤机过滤对循环水养殖系统水体弧菌和异养细菌数量的影响

循环水养殖系统水体中细菌数量变动与系统中的有机质、营养盐状况密切相关，而养殖水体中营养物质分布并不均匀，微藻、饲料、粪便等固体悬浮物的营养物质往往远高于周围水体。营养物质缓慢从固体悬浮物中释放出来，致使海水中的营养物质分布是作为热点出现的[20]，部分细菌趋向并依附于高营养的区域[21-23]。因此，去除固体悬浮物在大幅降低养殖水体营养物质含量的同时，将附着于固体悬浮物的细菌一并去除，进而导致养殖水体中的细菌总数发生变化。本研究中，以池A与池B养殖水体进行比较，池B弧菌总数均低于池A。同时，除试验第1天外，池B异养细菌总数亦低于池A。

3.2微滤机过滤对循环水养殖系统水体细菌空间分布的影响

Lauro等[21-23]研究表明水产养殖水体细菌可分为r-策略菌群和k-策略菌群，其中r-策略菌群多数具有较好适应力和较强的运动性，在营养相对贫乏的养殖水体中趋向于营养丰富的固体悬浮物。k-策略菌群多数体积小，能够最大限度地吸收单位水体的营养，同时由于其代谢可塑性差，无法利用固体悬浮物中组成复杂的营养物质，因而在营养相对贫乏的养殖水体中对固体悬浮物不具有趋向性[21-23]。本试验对典型r-策略菌群的弧菌属和k-策略菌群的红细菌科以FISH技术检测池A与池B养殖水体细菌空间分布变化，结果显示，r-策略菌群的弧菌属对固体悬浮物具有趋向性，而r-策略菌群对固体悬浮物的趋向性可能导致了池A与池B养殖水体细菌空间分布的不同。

3.3 微滤机过滤对循环水养殖系统水体细菌群落结构的影响

在本试验中，池A和池B养殖水体菌群结构变化明显，其中池B养殖水体弧菌属所占细菌总量比例均显著低于池A；除试验第30天的红细菌科所占细菌总量比例存在波动外，其他时间点的池B养殖水体的红细菌科所占细菌总量比例显著高于池A。水产养殖中的大多数细菌性疾病是由弧菌属等机会性病原菌引起的，这些病原菌在海洋环境中无处不在，且多数为r-策略菌群[20,24-25]。Lemire等[26]就曾于2015年报道牡蛎的致病弧菌属对浮游动物和大颗粒物质具有偏好性。红细菌科属于典型k-策略菌群，是海洋生态系统中分布最广的一类海洋细菌，沿岸地带和极地分布尤其多[27]。该细菌能够利用多种基质作为碳源进行混养的光合代谢反应及CO2和氮的固定，在循环水养殖系统的碳、氮循环中具有重要的调节作用[28-29]。本试验的池B以微滤机过滤了养殖水体中的固体悬浮物，使营养物质分布较均匀，降低了养殖水体菌群中r-策略菌群的弧菌属组成比例的同时，k-策略菌群的红细菌科组成比例大幅升高，从而较大限度地降低循环水养殖系统病害爆发的概率[26]。

3.4 微滤机的运行效率

微滤机运行时，大于滤网孔径的颗粒物被拦截，截留的颗粒物随时间的推移而增多，进而导致滤膜堵塞，过滤效率降低，即使微滤机顶部设计了反冲洗装置，但实际应用效果有限[30-31]。本研究在试验第60天时，池B养殖水体弧菌所占总细菌的比例大幅上升。同时，试验第30天和第60天的池B养殖水体细菌多样性无显著性差异，由此判断此时微滤机工作已接近饱和。因此，建议微滤机在运行60 d左右时需及时进行滤膜的更换或清洗。未来研究还需要在不同工况下，比较微生物组成差异，从而更科学地对微滤机滤膜的更换时间进行判断。

4 结论

通过对微滤机过滤前后的细菌种群结构进行系统性分析表明循环水养殖系统中安装微滤机过滤装置可以在去除固体悬浮物的同时有效降低潜在病原菌的数量。在养殖第60天时，池A和池B养殖水体弧菌和细菌数量均大幅增长，因此建议微滤机在运行60 d后需及时对滤膜进行更换或清洗。本研究为微滤机的使用方法提供了一定的技术参考。

□