大气CO2浓度升高和土壤镉污染耦合对刺槐幼苗根系酚酸积累的影响

曹柯萌，贾 夏，，王子威，闫占宽，张宁静

（1.长安大学水利与环境学院旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，西安 710054；2.长安大学土地工程学院陕西省土地工程重点实验室，西安 710054；3.江苏恒瑞医药股份有限公司，江苏连云港 222000）

酚酸是高等植物中广泛分布的一类重要次生代谢物，作为信号分子，酚酸在植物与微生物的共生、植物防御及抵抗不良环境等方面起重要作用［1-2］，可调节植物生长，并具有抗氧化、酶抑制及紫外线阻断作用；同时，作为合成木质素的中间体，酚酸类物质对于植物结构的形成也具有重要作用；此外，根系酚酸的积累除可能提高根系分泌酚酸的能力外，还有助植物根系抵抗不利环境.而酚酸的合成易受环境变化如气温、大气CO2浓度和土壤重金属污染的影响，因而这些环境因子的变化会影响根系酚酸的积累.

大气CO2浓度呈逐年上升趋势已获国际社会的广泛认可［3］.研究表明，大气CO2浓度升高下植物光合产物明显增加［4-6］，而光合产物的增加可影响植物次生代谢产物的合成［7-9］，进而影响其根系次生产物的含量.此外，土壤重金属污染也是目前面临的一类重要无机污染问题，其中镉（Cd）是土壤污染主要类型之一［10］.研究表明，Cd会诱导植物酚酸的生物合成及积累［6］，而酚酸的羟基和羧基等具有络合重金属的能力［11-12］，故可降低金属的自由离子态浓度，缓减其对植物的生物毒性.在当前大气CO2浓度升高和土壤Cd污染共存情景下，植物酚酸合成可能不同于单一条件［13-14］，而这种差异会影响其根系酚酸的积累特征，进而影响Cd的生物可以利用性，关系污染土壤的植物修复效率，然而，目前这方面的研究还甚少见.据此，本研究以刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）幼苗为例，探究大气CO2浓度升高和土壤Cd污染耦合对其根系酚酸含量的影响.

刺槐生长速度快、根系发达、更新萌芽能力强、幼苗成活率高及耐干旱贫瘠等［15-16］，是我国“三北防护林工程”、农田防护林及干旱半干旱地区水土保持的主要造林树种之一，在改善区域生态环境和生态服务功能等方面具有重要意义［15］.已有研究表明刺槐可合成多种酚酸类化合物如对羟基苯甲酸、没食子酸、对香豆酸和咖啡酸［17-20］，故本研究主要探讨大气CO2浓度升高和土壤Cd污染耦合对刺槐幼苗根系酚酸类化合物积累的影响特征，其研究结果对了解全球变化背景下植物对土壤重金属污染的抗性特征具有重要科学意义.

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤来源于长安大学渭水校区原位试验场，土壤类型为淋溶土，其基本理化性质为pH值7.69，总碳12.51 g·kg-1，总氮1.31 g·kg-1，有效氮11.14 mg·kg-1，速效磷48.66 mg·kg-1，速效钾151.97 mg·kg-1，阳离子交换量27.99 meq·（100 g）-1，可溶性盐376.14 mg·kg-1，总Cd 2.88 mg·kg-1.除去杂物后过2 mm筛混匀，向土壤中添加CdSO4·8H2O水溶液后混匀，暗处放置平衡5个月（期间经常搅拌以使Cd分布均匀）.依据国家《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）关于pH＞7时Cd的农用地土壤污染风险筛选值（0.6 mg·kg-1）和风险管制值（4.0 mg·kg-1）共设0、0.45和4.5 mg·kg-1干土3个Cd处理水平，分别记为Cd0、Cd1和Cd10.刺槐种子购置于西北农林科技大学林业科学研究院.

1.2 试验设计

将平衡好的土壤装入实验盆（长30 cm×宽15 cm×高20 cm），每盆装处理土壤约10 kg，以一定株距和行距种植刺槐种子后将盆栽放入带有CO2浓度控制系统的植物培养箱（Percival E-36L2，美国）和对照箱进行培养.

CO2浓度设置2个水平：高浓度CO2（750μmol·L-1）和大气CO2浓度（385μmol·L-1）.耦合处理分为高浓度CO2+Cd（Cd0、Cd1和Cd10）和大气CO2+Cd（Cd0、Cd1和Cd10）两大类，具体处理如下.对照：大气CO2-Cd0；单独Cd处理：大气CO2-Cd1和大气CO2-Cd10；单独大气CO2浓度升高：高浓度CO2-Cd0；耦合条件处理：高浓度CO2-Cd1和高浓度CO2-Cd10；每处理重复3次.

幼苗培养参数：湿度为65%～69%，平均温度为25℃，平均光通量550μmol·m-2·s-1，光周期12 h.幼苗生长期间定期用自来水浇灌，保持土壤田间持水量约为62.7%.在实验过程中及时清理盆中杂草和凋落叶片，并经常更换盆栽位置以减少培养箱小气候的影响.

1.3 样品采集及所选指标分析

1.3.1 根系样品采集 在幼苗生长45、90和135 d时挖取幼苗根系，经自来水冲洗干净后于95℃烘箱杀青5 min并在65℃下烘干至恒重，干根经粉碎后备用.

1.3.2 根系酚酸提取及总酚酸含量的测定 准确称取根粉5 g，用25 mL 50%的乙醇混匀后回流提取1 h后过滤，滤液经浓缩定容至25 mL后备用.总酚酸含量以咖啡酸为标样，采用普鲁士蓝比色法测定［21］.

1.3.3 几种酚酸单体含量测定 标准品溶液制备：配制浓度为2、5、10、20和32μg·mL-1的没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸和对香豆素酸标准溶液，经0.22μm滤膜过滤后经高效液相色谱（日本岛津，LC-2030C 3D Plus）制作标准曲线.色谱条件：色谱柱为Shim-pack GIST反相C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相采用pH 2.7的冰乙酸和乙腈进行梯度洗脱，梯度变化见表1；柱温为30℃，流速为1.0 mL·min-1，进样量为10μL.检测器为二极管阵列检测器，检测波长为285 nm.

样品溶液制备：浓缩土壤提取溶液近干至浸膏，用色谱甲醇定容至10 mL，过0.22μm滤膜过滤得待测样液用于高效液相色谱分析酚酸单体含量.

1.3.4 根系Cd含量分析 根系Cd含量数据已出版［22］，本文仅引用来分析其对根系酚酸积累的影响.

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedures

1.4 数据处理

数据分析采用SPSS20.0软件.采用三因素方差分析法分析CO2、Cd、时间及其交互作用对刺槐根系酚酸积累的影响，影响显著时采用Duncan（邓肯新复极差法，Duncan’s multiple range test）分析不同处理间的差异性；采用皮尔逊相关分析法分析酚酸积累和根系Cd含量的关系.绘图采用利用Sigmaplot14.0软件进行.

2 结果与分析

图1 不同处理下刺槐幼苗根系总酚酸含量Fig.1 The content of total phenolic acids in the roots of R.pseudoacacia seedlings under different treatments

2.1 大气CO2浓度升高和土壤Cd污染耦合对幼苗根系总酚酸积累的影响

由图1可知，大气CO2-Cd1和大气CO2-Cd10处理下幼苗根系总酚酸积累在45 d时较大气CO2-Cd0下显著增加（P＜0.05），而90和135 d时较大气CO2-Cd0下显著降低（P＜0.05），总体上酚酸积累随生长时间的延长而增加，且135 d时酚酸含量最高.高浓度CO2-Cd0处理下，总酚酸积累在90 d时较大气CO2-Cd0下显著增加（P＜0.05），135 d时较大气CO2-Cd0下显著降低（P＜0.05），且随着生长时间的延长，根系总酚酸积累较45 d时显著增加（P＜0.05）.耦合处理下，总酚酸积累均较大气CO2-Cd0降低，但较单一Cd处理下显著增加（P＜0.05）.总体看，CO2、Cd及生长时间对根系总酚酸积累的单一及交互作用显著（P＜0.05）（表2）.

表2 刺槐幼苗根系酚酸含量的三因素方差分析结果（F值和显著性）Tab.2 The data on three-way ANOVA of phenolic acids in the roots of R.pseudoacacia seedlings

2.2 大气CO2浓度升高和土壤Cd污染耦合对幼苗根系几种酚酸单体化合物积累的影响

根系中共检出没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸6类酚酸单体.由图2可知，根系咖啡酸积累最多，对香豆酸积累最少，且对羟基苯甲酸、对香豆酸和阿魏酸随幼苗生长时间的延长积累量降低，而没食子酸、绿原酸和咖啡酸却表现为增加.大气CO2-Cd1和大气CO2-Cd10处理下，没食子酸、对羟基苯甲酸和咖啡酸积累在幼苗生长45和135 d时较大气CO2-Cd0下显著降低（P＜0.05），而90 d时，Cd1处理下较大气CO2-Cd0下显著增加（P＜0.05）；绿原酸积累在幼苗生长45 d时显著降低（P＜0.05），而90 d时大气CO2-Cd1处理显著促进了绿原酸的积累；阿魏酸在幼苗生长45和135 d时大气CO2-Cd1处理促进了其积累，而90 d时却降低.耦合处理下，没食子酸和绿原酸较大气CO2-Cd0下显著增加（P＜0.05），而其他酚酸积累在幼苗不同生长时间表现不同.高浓度CO2-Cd1和高浓度CO2-Cd10下没食子酸、对香豆酸和阿魏酸积累在幼苗生长135 d时均较大气CO2-Cd1和大气CO2-Cd10处理下显著升高（P＜0.05），总体上根系不同种类酚酸积累在耦合条件和单一Cd处理下差异显著（P＜0.05），但未表现出一致的变化规律.此外，CO2、Cd及生长时间对根系酚酸单体含量的单一及交互作用显著（P＜0.05）（表2）.

图2 不同处理下刺槐幼苗根系几种酚酸单体的含量Fig.2 The content of phenolic acid monomers in the roots of R.pseudoacacia seedlings under different treatments

2.3 幼苗根系酚酸含量与其Cd含量的关系

根据已报道研究的根系Cd含量数据（表3），分析其对根系酚酸积累的影响.通过对各酚酸单体与根系Cd含量的皮尔逊相关分析表明，刺槐幼苗根系总酚酸、没食子酸、绿原酸和咖啡酸积累和根系Cd含量呈显著负相关，而对香豆酸和阿魏酸积累和根系Cd含量呈显著正相关，但对羟基苯甲酸的积累和根系Cd含量相关性不显著（表4）.

表3 不同处理下幼苗根系Cd含量（平均数±标准误差）［22］Tab.3 The content of Cd in roots of R.pseudoacacia seedlings under different treatments

表4 刺槐幼苗根系酚酸与根系Cd含量的皮尔逊相关分析结果Tab.4 The Pearson correlation analysis between phenolic acids in roots of R.pseudoacacia seedlings and Cd in the roots

3 讨论

3.1 大气CO2浓度升高对幼苗根系酚酸含量的影响

由结果可知，大气CO2浓度升高对刺槐幼苗根系总酚酸和几种酚酸单体含量影响显著.总体上，总酚酸和没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸和咖啡酸的积累对大气CO2浓度升高的响应规律相似，而对香豆酸和阿魏酸的积累对CO2浓度升高的响应规律不同，表明刺槐根系不同种类酚酸的合成对大气CO2浓度升高的响应存在差异性.就测定的几种酚酸来看，咖啡酸对总酚酸积累的贡献最大，且是刺槐根系合成的主要单体酚酸，而阿魏酸是合成量最少的酚酸.此外，总酚酸含量随幼苗生长时间的延长表现出显著增加现象，没食子酸、绿原酸和咖啡酸也表现出了类似的规律，表明大气CO2浓度升高对刺槐根系酚酸合成的影响存在时间效应，这可能与幼苗在不同生长时间段其酚酸的合成代谢支路及合成量不同有关.此外，已有研究表明，大气CO2浓度升高会显著提高植物光合产物产量［23-24］，由此会提高光合产物分配到次生代谢物合成途径的比例［24］，从而根系的次生代谢物分配比例亦会增加，故大气CO2浓度升高下根系总酚酸和咖啡酸等几种酚酸单体合成量的增加可能与刺槐幼苗生物量的增加有关［22］.此外，幼苗生长时间和CO2对酚酸积累的显著交互作用表明大气CO2浓度升高和幼苗生长时间对根系酚酸合成表现出了相互调节作用.

3.2 土壤Cd污染对幼苗根系酚酸积累的影响

重金属胁迫下，根系通过调整次生代谢物的合成以缓解重金属的毒害作用.研究表明Cd胁迫会损伤植物细胞清除自由基的能力，由此植物会合成酚酸等次生代谢物以缓减自由基带来的细胞膜损伤［4］，而合成量的增加会提高根系的分配比例，从而会增加根系酚酸的含量.由皮尔逊相关分析结果可知根系总酚酸及除对羟基苯甲酸外的几种单体酚酸积累呈显著相关性.然而，除对香豆酸和阿魏酸外，总酚酸、咖啡酸、对羟基苯酸、绿原酸和没食子酸积累都与根系Cd含量呈显著负相关.表明Cd对刺槐幼苗根系这几种酚酸合成的诱导效应较弱；而对香豆酸和阿魏酸与根系Cd含量的显著正相关表明Cd对这两种酚酸的合成具有明显诱导作用，尽管两种酚酸的合成量较低，但可能对协助幼苗抵抗Cd对其根系的过氧化损伤中起重要作用.此外，Cd与幼苗生长时间对根系酚酸积累的显著交互作用也暗示了土壤Cd污染对幼苗根系酚酸合成的影响可能会随生长时间的延长而加强.

3.3 大气CO2浓度升高与Cd污染耦合对幼苗根系酚酸积累的影响

耦合条件下总酚酸与没食子酸、对香豆酸和阿魏酸的变化规律相同，表明Cd污染下这几种酚酸的合成对大气CO2浓度升高的响应规律相似，而这种响应与CO2浓度升高下根系Cd浓度较单一Cd污染下降低有关，相关性分析结果也表明了这点，且没食子酸、对香豆酸和阿魏酸在耦合条件下对幼苗的抗性调节具有重要作用，因而合成量会增加.此外，幼苗生长135 d时，大气CO2浓度升高显著降低了Cd处理下绿原酸、对羟基苯甲酸和咖啡酸的含量，表明土壤Cd污染下根系这几种酚酸的合成随着幼苗生长时间的延长，表现出了对大气CO2浓度升高适应的现象，此时幼苗的其他抗性系统如抗氧化酶可能起主要的抗氧化作用［4-7］.而CO2、Cd和时间对根系酚酸的显著交互作用表明CO2浓度升高和Cd污染耦合对幼苗酚酸合成的调节作用受幼苗生长时间影响显著.

4 结论

1）根系总酚酸、绿原酸和咖啡酸含量随幼苗生长时间的延长而增加，而对羟基苯甲酸、对香豆酸和阿魏酸含量随幼苗生长时间的延长表现为降低现象.

2）整体上，随着刺槐幼苗生长时间的延长，大气CO2浓度升高促进了土壤Cd污染下根系总酚酸、没食子酸、对香豆酸和阿魏酸的合成，降低了咖啡酸和绿原酸的合成量.

3）大气CO2浓度升高与土壤Cd污染耦合条件下刺槐幼苗根系酚酸的合成与CO2浓度升高对根系Cd吸收的影响显著相关，且根系除了抗氧化酶系统外，可能主要通过合成没食子酸、对香豆酸和阿魏酸来抵抗Cd的毒性损伤.