微波辐射对雄性小鼠睾丸损伤与性激素的影响及补肾疗法的干预作用

毕焕洲，马顺水，彭 超，李 纯，姜美娴

(1北京中医药大学深圳医院(龙岗)·深圳 518172；2湖北医药学院附属太和医院·湖北 十堰 442008；3 大连大学附属中山医院·辽宁 大连 116001；4辽宁中医药大学附属第二医院·辽宁 沈阳 110034)

睾丸是微波辐射的靶器官，手机、笔记本电脑、wi-fi等微波过度暴露，即可使睾丸生精细胞受损，光镜下可见睾丸中生精细胞大量减少甚至消失、精子数量过少，导致男性不育症[1-2]，又可以使生殖细胞之外的睾丸微环境受损，导致睾酮降低，从而影响性功能[3-4]。微波辐射的中医证候学研究表明，微波辐射为火热之邪，先伤肺气后伤脾气，当微波过度暴露时，最终伤及肾气、肾阳[5]。金匮肾气丸可以治疗微波辐射性生精功能障碍[6]，还能提高糖尿病导致的睾酮水平及性功能低下[7]，但对微波辐射性睾酮水平降低及性功能障碍的疗效及作用机理尚缺明确结论。本研究从微波辐射对睾丸损伤入手，研究微波对雄性小鼠性腺功能的影响，并应用补肾代表方金匮肾气丸进行治疗，研究其疗效及治疗机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级8周龄健康雄性BALB/C小鼠30只，体质量20～30 g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2008-0002。小鼠在大连大学附属中山医院实验室进行环境适应1周，适应期间照明采用12 h明/暗周期(早7:00-晚7:00),自由饮水进食，二级喂养。

1.2 药物、试剂及主要仪器 金匮肾气丸：北京同仁堂，批准文号：国药准字Z20055685，批号：16033212。睾酮(T)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、泌乳素(PRL)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)试剂盒：上海朗顿公司。KJ-6200B型微波治疗仪：徐州市万诺医疗设备有限公司生产；HI-1501型微波泄露检测仪：美国ETS-Lindgren生产；电子天平AR1140：梅特勒-托利多仪器上海有限公司制造；共聚焦显微镜：日本Nikon；YTD-2002系列医学影像工作站：徐州市永泰电子科技有限责任公司；PT-MR 1600E组织粉碎机：KINEMATICA AO POLYTRON,Switzerland,。

1.3 模型制备 本实验采用毕焕洲等[8]研究的造模方法：即将小鼠分别暴露于频率为2 450 MHz连续微波，功率密度为40 mW/cm2，辐射18 d，每天辐1 h。

1.4 分组及处理 雄性BALB/C小鼠30只，随机分为正常对照组10只，不造模，但为保持相同实验条件置于微波灯下不辐射18 d，喂饲0.9%氯化钠溶液0.1 mL/d；辐射组10只，微波辐射造模后，喂饲0.9%氯化钠溶液0.1 mL/d；金匮肾气丸组10只，微波辐射造模后，金匮肾气丸0.2 g/(kg·d)(即成人临床等效剂量)0.1 mL灌胃；连续灌胃18 d。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 小鼠性行为学实验 实验在隔音、恒温的动物行为学实验室内进行。将小鼠依次放入鼠笼中适应5 min，随后以1∶1的雌雄比投入同批饲养的健康雌性小鼠，观察60 min内以下指标变化：①扑捉潜伏期(capture incubation period，CIP)：自雌鼠投入开始计时，至雄鼠第一次扑捉雌鼠的时间。②扑捉次数(capture times，CT)：自雌鼠投入60 min内，雄鼠扑捉雌鼠或爬背或舔阴动作次数。

1.5.2 睾丸组织病理变化观察 取小鼠另一侧睾丸放入鲍温氏液中固定24 h，石蜡包埋，将睾丸切成厚约4μm的连续石蜡切片，HE染色后光镜观察，判断睾丸微环境的形态与结构的改变，即管周肌样细胞的形态及结构，生精小管形态及结构，生精小管界膜的完整性，支持细胞的形态及结构，支持细胞间的链接状态，间质细胞的形态及结构等等。

1.5.3 性激素检测 各组小鼠眼部取血，进行血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、泌乳素(PRL)含量检测。取小鼠一侧睾丸，粉碎匀浆，并将匀浆分成两份，取一份进行睾酮(T)、雌二醇(E2)测定。

1.5.4 睾丸组织炎性因子检测 取小鼠睾丸组织匀浆的另一份，ELISA法进行白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)水平测定。

2 结果

2.1 微波辐射对小鼠性行为的影响及金匮肾气丸的干预效果 见表1。

表1 各组小鼠性行为实验结果比较

2.2 微波辐射对小鼠睾丸组织学变化的影响及金匮肾气丸的干预效果 微波辐射后，睾丸管周肌样细胞结构异常；曲细精管上皮排列疏松，曲细精管界膜不完整，甚至曲细精管管腔断裂，管腔内可见蛋白水肿液和脱落细胞；支持细胞变性、坏死脱落，间质细胞数目减少，睾丸微环境损伤明显；各类生精细胞排列不整齐，层次不清楚，精母细胞、精子细胞变性、坏死脱落，精细胞数目明显减少，甚则曲细精管内无精子细胞存在。金匮肾气丸组小鼠管周肌样细胞、支持细胞、间质细胞结构正常，曲细精管界膜完整平坦，曲细精管内可见成熟精子，各类生精细胞排列整齐，层次清楚。见图1。

图1 各组小鼠睾丸组织变化的光镜观察(HE，×200)

2.3 微波辐射对小鼠性激素的影响及金匮肾气丸的干预效果 见表2～表3。

表2 各组小鼠血清性激素水平测定结果比较

表3 各组小鼠睾丸组织性激素水平测定结果比较

2.4 微波辐射对小鼠睾丸炎性损伤的作用及金匮肾气丸的干预效果 见表4。

表4 各组小鼠睾丸组织IL-1β、IL-6含量比较

3 讨论

前期研究表明，微波辐射可以损伤睾丸而影响生精，可使精子总活率(PR+NP)、前向运动精子活率(PR)及睾体比显著降低，精子畸形率增高，金匮肾气丸干预后，这些损伤得到了恢复[8]。睾丸易被微波损伤，微波辐射可直接损伤睾丸中的生殖细胞，但也会损伤生殖细胞之外的睾丸微环境，而改变的睾丸微环境可使生殖细胞受到二次损伤，包括微波导致的炎性损伤和性激素环境的改变。

在成年动物睾丸组织中，精原干细胞及各级雄性生殖细胞位于由支持细胞(sertoli cells)组成的龛境里，其外围由基底膜包绕，共同组成了生精小管。生精小管外围环绕着管周肌细胞(myoid cells)、间质细胞(Leydig cells)、巨噬细胞、血管等间质组织。这些体细胞及其合成分泌的各种细胞因子共同构成了精子发生的微环境，即睾丸微环境(microenvironment, niche)[9]。睾丸组织的微波损伤，也意味着睾丸微环境有所改变。睾丸微环境中的间质细胞受损后，睾酮的分泌会受到影响，降低的睾酮可影响生精过程，也可以导致性功能障碍[3-4]。

本研究表明，微波辐射后，睾丸管周肌样细胞、支持细胞变性、各类生精细胞及间质细胞都出现了结构异常，金匮肾气丸干预后，各类生精细胞恢复正常。微波辐射后小鼠睾丸组织中的IL-6显著升高，IL-1β没有明显改变，但服用金匮肾气丸后，睾丸组织中的IL-6及IL-1β皆显著降低。微波辐射后小鼠睾丸组织中的睾酮水平没有明显改变，但小鼠血中T水平显著降低；应用金匮肾气丸后，睾丸组织及血中睾酮皆明显增高，与正常小鼠无显著差别，提示恢复至正常水平。微波辐射后，血LH、FSH、PRL水平没有明显改变，但金匮肾气丸干预后，血LH及PRL水平明显增高，血FSH水平没有明显改变。

上述结果表明，微波辐射可以导致睾丸组织出现炎性改变，表现为IL-6等炎性因子的增高及睾丸微环境损伤。间质细胞损伤可使血中T水平显著降低，既可导致生育障碍，又可导致性功能障碍。金匮肾气丸可以降低睾丸组织中的IL-6和IL-1β水平，消除微波导致的炎性反应，为生精细胞及间质细胞创造了一个良好生存环境。金匮肾气丸治疗后血LH水平增高。LH又称为间质细胞刺激素，具有刺激睾丸间质细胞产生T的作用，因此提高了血中T水平。表明其另一个作用机理是调节下丘脑-垂体-睾丸性腺轴，促进血LH水平，而非直接补充T。表明金匮肾气丸即可以通过修复微波辐射损伤睾丸微环境保护间质细胞以维持T正常分泌，又可以通过提高LH水平促进T分泌，从而治疗辐射性雄小鼠性腺功能减退。PRL有垂体分泌，金匮肾气丸可使PRL水平显著升高，表明药物作用到垂体，但其具体的作用机理，有待于进一步研究。