黄芩苷对肺炎支原体感染肺上皮细胞增殖的影响

王 博，王晓溪，徐慧星，王 欣，蒙艳丽，王伟明

(黑龙江省中医药科学院中药所·黑龙江 哈尔滨 150036)

肺炎支原体(M. pneumoniae)是引起呼吸道感染的常见病原体之一，被认为是肺炎、支气管炎、细支气管炎和其他呼吸道综合征的主要病因[1-2]。目前临床上对于支原体肺炎的治疗以大环内酯类抗生素为主，但该类抗生素耐药性强，不良反应多[3]。本院自主研制的芩百清肺浓缩丸由黄芩、百部等天然药物提取而成，该药已被批准为临床治疗支原体肺炎的有效新型中药。前期实验研究和临床观察表明，芩百清肺浓缩丸具有较好的抗肺炎支原体和修复肺组织损伤作用，且副作用小，有助于解决大环内酯类抗生素的耐药问题[4-5]。

黄芩苷是芩百清肺浓缩丸的重要成分之一，由黄芩的根茎中提取，具有抗菌抗炎、解热镇静的作用，被认为是治疗肝炎、肺炎、癌症等过敏性和炎症疾病的经典药物[6]。在前期药效学研究中发现，黄芩苷的体外最小抑菌浓度(MIC)为16 mg/L[7]。本实验采用黄芩苷MIC 2倍剂量作为高剂量组干预经肺炎支原体感染后的A549细胞，通过MTT法、划痕实验、克隆实验分析浓度依赖性对细胞增殖的影响，采用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞染色法观察黄芩苷对细胞内PCNA蛋白表达的影响，为进一步说明芩百清肺浓缩丸对支原体肺炎具有治疗作用提供基础理论依据。

1 材料

1.1 药品 黄芩苷购自黑龙江省药品检验所；用超纯水配置黄芩苷储备液，用RPMI-1640培养基稀释储备液，配制成16 mg/L和32 mg/L两种剂量浓度的黄芩苷溶液。

1.2 肺炎支原体 肺炎支原体(ATCC 15531)购自American Type Culture Collection；肺炎支原体在胎牛血清中培养24 h后，置于含有20%胎牛血清、10%酵母和1%葡萄糖的PPLO培养基中，5% CO2的恒温培养箱37 ℃恒温培养，每隔7 d传代1 次。

1.3 细胞 A549细胞购自中国科学院上海细胞库；细胞培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于5%CO2恒温培养箱37 ℃恒温培养，每隔3 d传代1 次。

1.4 试剂和仪器 PPLO培养基：BD，美国；RPMI-1640培养基和胎牛血清：Hyclone，美国；新鲜酵母(安琪酵母)：中国；兔抗PCNA多克隆抗体和山羊抗兔IgG抗体：Abcam，美国；MTT和DMSO：Sigma，美国。Tecan Infinite M200型多功能酶标仪：Tecan，瑞士；BX4-1生物显微镜：Olympus，USA；S40-Slider莱卡显微镜：Leica，德国。

2 方法

2.1 细胞毒性实验 MTT 法。将对数生长期的A549细胞按每孔4×103个接种于96 孔板上，分为对照组和实验组，实验组分别加入4、8、16、32、64、128、256、512 mg/L黄芩苷溶液，每组重复3 孔，置于5%CO2恒温培养箱37 ℃，培养3 d。每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，加入150 μL DMSO，摇床低速振荡10 min。用Tecan Infinite M200 PRO酶标仪在490 nm处测定吸光度值，并计算细胞存活率。

2.2 细胞增殖实验 将细胞分为空白对照组、模型对照组、黄芩苷高剂量组(32 mg/L)和黄芩苷低剂量组(16 mg/L)，每孔4×104个细胞。模型对照组和高、低黄芩苷剂量组按20 μL 106CCU肺炎支原体浓度感染细胞，置于5%CO2恒温培养箱内37 ℃孵育4 h。黄芩苷两剂量组分别在培养基中滴加32 mg/L和16 mg/L黄芩苷溶液，培养3 d。加入MTT溶液培养4 h后，加入150 μL DMSO处理10 min，用酶标仪在490 nm处测定吸光度值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=(给药组OD-模型对照组OD)/模型对照组OD×100%。

2.3 感染细胞修复能力检测 细胞划痕实验。细胞按每孔2×104个接种于6 孔板上，5%CO2恒温培养箱内37 ℃培养24 h，用无菌吸管头在孔内画直线划痕。按2.2方法进行分组、感染和处理细胞。干预3 d后，用莱卡显微镜拍摄细胞图像，采用Image J2x软件进行数据分析。

2.4 感染细胞集落形成实验 细胞按每孔1×103个接种于6 孔板上，按2.2方法分组、感染和处理细胞，培养7 d后终止，PBS冲洗，甲醛固定后进行吉姆萨染色。每孔选5 个焦点用莱卡显微镜进行拍照(每个焦点细胞克隆数>20)，计算集落形成率。

2.5 PCNA蛋白表达的检测 免疫细胞化学染色。细胞按每孔2×104个接种于6 孔板上，按2.2方法分组、感染和处理细胞。干预3 d后弃去培养液，加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS清洗。加入0.3%过氧化氢甲醇溶液封闭，0.2%Triton X-100通透10 min，PBS清洗。滴加PCNA一抗，4 ℃湿盒过夜。加入二抗，室温静止2 h后PBS清洗。显色剂显色，树胶封片，用Olympus显微镜观察细胞并评分。每张细胞爬片选3个视野，以着色深浅程度及其面积计分判定：细胞核出现黄色颗粒为PCNA蛋白表达阳性，浅色为弱阳性计1分，棕黄色为中等阳性计2分，褐色为强阳性计3分；着色细胞面积数<25%计1分，25%～49%计2分，>50%计3分；以二者相乘的综合积分计量，<3为阴性，>4为阳性，>6为强阳性。

2.6 细胞形态观察 细胞按每孔2×104个接种于6 孔板上，按2.2方法分组、感染和处理细胞。培养3 d后终止，甲醇固定后，行HE染色，采用Olympus显微镜观察细胞形态。

3 结果

3.1 黄芩苷细胞毒性检测结果 MTT实验结果表明，黄芩苷干预3 d 后在4～512 mg/L浓度范围内无细胞毒性，细胞存活率为100%。

3.2 黄芩苷对感染细胞活力的影响 经不同浓度黄芩苷处理3 d后的肺炎支原体感染细胞，黄芩苷高、低剂量组较模型组有一定的促进细胞增殖作用，且高剂量组差异显著 (P<0.05)。见表1。

表1 各组A549细胞增殖的比较

3.3 黄芩苷对感染细胞修复能力的影响 与空白对照组相比，模型组划痕最长，表明经肺炎支原体感染后细胞修复能力明显减弱。与模型对照组相比，黄芩苷给药组细胞修复能力增强，且高剂量组最为显著(P<0.05)，说明黄芩苷对细胞修复有改善作用。见表2。

3.4 黄芩苷对感染细胞集落形成的影响 经黄芩苷处理后的感染细胞，各给药组细胞集落形成率明显升高，与模型组相比差异显著(P<0.05)，说明黄芩苷能诱导细胞生长。见表2。

3.5 黄芩苷对感染细胞PCNA蛋白表达的影响 与模型对照组相比，黄芩苷高、低剂量组细胞PCNA蛋白表达量升高，且差异显著(P<0.05)。其中高剂量组染色度最深，为深褐色，说明高浓度黄芩苷对PCNA蛋白敏感性更强，细胞增殖作用明显。见表2。

表2 黄芩苷对肺炎支原体感染细胞划痕长度、集落形成率和PCNA蛋白表达评分的影响

3.6 黄芩苷对感染细胞病理变化的影响 见图1。

图1 各组细胞形态观察(HE，×40)

如图1所示，模型组细胞密度降低，数量较空白对照组明显减少，凋亡细胞增多，细胞严重水肿变性，细胞膜破裂核脱出，失去细胞正常形态结构。与模型对照组相比，黄芩苷高、低剂量组细胞数量明显增多。低剂量组存在少量细胞水肿、边缘模糊现象。高剂量组细胞形态完好，密度大，结构完整，核深染，说明黄芩苷对细胞形态有明显恢复作用。

4 讨论

黄芩性甘、平，无毒，是中华传统中药，史载于《神农本草经》，有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效。黄芩苷是黄芩的主要活性成分[8]，现代研究表明黄芩苷具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗癌等多种药理作用[9]，对呼吸、免疫、消化、神经系统等都具有保护作用[10]。

本实验首先通过MTT法评价黄芩苷的细胞毒性作用，黄芩苷在4～512 mg/L浓度范围内无抑制细胞增殖现象。课题组前期研究结果表明，黄芩苷在16 mg/L浓度时可以抑制肺炎支原体生长，为其最小抑菌浓度[8]。本实验选用黄芩苷MIC和MIC 2倍剂量处理肺炎支原体感染的A549细胞。通过MTT法、划痕实验和细胞克隆实验观察黄芩苷对感染细胞活力的影响。黄芩苷高剂量组细胞划痕修复能力和集落形成率均与空白对照组相近，说明黄芩苷具有较强的诱导细胞生长的能力，可促进细胞增长和活力的恢复。细胞内PCNA蛋白表达量升高，提示黄芩苷可能存在启动细胞增殖机制，参与DNA的合成。进一步的细胞HE染色更好地说明黄芩苷对感染细胞的损伤有修复作用，可使细胞密度增大，结构完整。

以上实验结果说明，黄芩苷对肺炎支原体感染后肺上皮细胞具有明显的细胞增殖作用，可促进细胞生长，恢复细胞活力。本研究为黄芩苷对支原体肺炎的临床应用奠定了基础理论依据。