大黄素对肺炎链球菌肺炎大鼠氧化应激损伤及miR-34a/SIRT1轴的影响

张小红，王红民，李杨，胡朝阳，李凤芝，常瑞，黄晗，靳莉

肺炎链球菌是一种球状革兰阳性菌，是引发儿童呼吸道感染致肺炎的最常见病原菌，全球每年至少有100万5岁以下儿童死于肺炎链球菌肺炎，尤其在发展中国家其危害更加严重［1-2］。抗生素虽可有效治疗肺炎链球菌肺炎，但研究显示，目前46.1%的侵袭性肺炎链球菌临床分离株存在多药耐药，因此积极寻找新型替代治疗药物具有重要临床意义［3］。大黄素是传统中药大黄的主要有效单体成分，药理学作用广泛，具有抗氧化、抗炎、调脂、免疫调节及抗肿瘤等多种功效［4-6］。研究报道，大黄素可通过提高机体抗氧化能力和抑制炎症反应等途径发挥对重症急性胰腺炎大鼠的保护作用［7］。但是，目前关于其对肺炎链球菌性肺炎氧化应激损伤的作用及机制尚不完全明确。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类可降解和抑制靶基因转录及表达的非编码小RNA，其中miR-34a与多种细胞的氧化应激损伤有关，可通过靶向抑制沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）在神经细胞［8］、人晶状体上皮细胞［9］及内皮细胞［10］等氧化应激损伤中发挥重要作用。本研究拟探究大黄素对肺炎链球菌肺炎大鼠模型氧化应激损伤及miR-34a/SIRT1轴的影响，以揭示其作用机制，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8周龄健康雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量200～230 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0011。大鼠在温度（22±2）℃、湿度60%～65%、光照/黑暗12 h/12 h环境下饲养，自由饮水、采食，适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 实验菌株 肺炎链球菌标准菌株，批号ATCC49619，购自上海硕欣生物科技有限公司。实验前1 d接种于血琼脂平皿上，置于37℃细菌恒温培养箱中培养24 h，使用时以无菌生理盐水调整为1.0×107CFU/mL（CFU：菌落形成单位）。

1.1.3 试剂 大黄素（批号：E7881）购自Sigma-Aldrich公司；Trizol试剂（批号：R0016）购自上海碧云天公司；miRNA实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒（批号：20180114）、PrimeScriptTMRT reagent Kit（批 号：20170211）、TB Green®Premix Ex TaqTMII（批号：20180120）均购自TaKaRa生物公司；大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：ab236712）、白细胞介素（IL）-6 ELISA试剂盒（货号：ab234570）、兔源一抗anti-SIRT1（批号：20190111）、anti-GAPDH（批号：20180225）、羊抗兔IgG二抗（批号：20180621）均购自英国Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（货号：BC0170、BC0020）购自北京索莱宝科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）ELISA检测试剂盒（货号：ml027901）购自酶联生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 参照文献［11］，采用气管滴加肺炎链球菌法制备肺炎模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠全身麻醉后仰卧固定放置于37℃保温垫的手术台上，常规消毒后，纵向切开颈部皮肤，暴露气管，经气管软骨环入针注射肺炎链球菌混悬液0.4 mL（1.0×107CFU/mL），第5天重复注射1次，第8天成功建立肺炎链球菌肺炎大鼠模型。

1.2.2 实验分组及给药 大鼠按照随机数字表法分假手术组、模型组、低剂量大黄素组、中剂量大黄素组、高剂量大黄素组，每组12只。假手术组除不注射肺炎链球菌混悬液外其他操作与模型制备相同。建模成功后24 h，低、中、高剂量大黄素组分别腹腔注射20、40、80 mg/kg大黄素溶液，每日1次，连续7 d；假手术组、模型组同时注射等量生理盐水。

1.2.3 标本采集 末次给药后24 h，各组大鼠常规麻醉后处死，开胸取双肺组织，部分置于液氮中保存备用，部分采用4%多聚甲醛固定24 h，常规梯度乙醇脱水后，石蜡包埋，制作0.5μm厚度切片，保存备用；另取部分肺组织制备10%匀浆液，3 500 r/min离心15 min后收集上清液，-80℃冰箱保存备用。

1.2.4 HE染色观察肺组织病理变化 肺组织切片常规脱蜡至水，苏木素染色、分化液处理、返蓝液返蓝、伊红染色、脱水、透明、风干、封片等步骤后，光学显微镜下观察各组大鼠肺组织病理学变化。

1.2.5 肺组织炎症因子水平检测 采用ELISA法检测肺组织匀浆上清液中TNF-α、IL-6水平，具体检测步骤参照试剂盒说明书进行。

1.2.6 肺组织氧化应激指标检测 采用可见分光光度法检测肺组织匀浆上清液中SOD、MDA水平，ELISA检测GSH-Px水平。

1.2.7 qPCR检测肺组织miR-34a、SIRT1 mRNA表达 Trizol法提取肺组织总RNA，紫外分光光度计检测其浓度及纯度，样品合格（OD260/280为1.7～2.2）后进行反转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。采用qPCR法检测miR-34a、SIRT1 mRNA表达，引物序列见表1。反应体系：TB Green Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA（50 mg/L）2μL，上、下游引物（10μmol）各0.8μL，ddH2O 6.0μL。反应条件：95℃30 s；95℃5 s，61℃31 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法对肺组织miR-34a、SIRT1 mRNA相对表达水平进行定量分析。

Tab.1 The primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.8 Western blot检测肺组织SIRT1蛋白表达 蛋白抽提试剂盒提取肺组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，并置于-80℃保存备用。取40μg样品进行SDS-PAGE电泳分离，PVDF膜转膜，室温封闭，加一抗anti-SIRT1（1∶2 000）、anti-GAPDH（1∶500），4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后，添加二抗IgG（1∶5 000），37℃孵育1 h，洗膜，显色，曝片，观察并分析各蛋白灰度值。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），组间多重比较采用SNK-q法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理改变 假手术组大鼠肺组织正常，无明显病理改变；模型组大鼠肺泡塌陷，有大量炎性细胞浸润；低、中、高剂量大黄素组肺组织炎性病变均减轻，其中高剂量大黄素组减轻效果最明显。见图1。

2.2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6水平比较 与假手术组相比，模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-6水平显著增高（P＜0.05）。与模型组相比，中、高剂量大黄素组大鼠肺组织TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05），高剂量大黄素组降低最明显，见表2。

Fig.1 Histopathological changes of lung tissues in five groups(HE staining,×400)图1 各组大鼠肺组织病理学变化（HE染色，×400）

Tab.2 Comparison of TNF-αand IL-6 levels in lung tissues between five groups表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6水平比较（n=12，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of TNF-αand IL-6 levels in lung tissues between five groups表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6水平比较（n=12，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，c与低剂量组大黄素组比较，d与中剂量大黄素组比较，P＜0.05

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2.3 各组大鼠肺组织SOD、MDA、GSH-Px水平比较 与假手术组相比，模型组大鼠肺组织SOD、GSH-Px水平显著降低，MDA水平显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，中、高剂量大黄素组大鼠肺组织中SOD、GSH-Px水平显著增加，MDA水平显著降低（P＜0.05），高剂量大黄素组改善最明显，见表3。

2.4 各组大鼠肺组织miR-34a、SIRT1 mRNA水平比较 与假手术组相比，模型组大鼠肺组织miR-34a水平显著增高，SIRT1 mRNA水平显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，中、高剂量大黄素组大鼠肺组织miR-34a水平显著降低，SIRT1 mRNA水平显著增高（P＜0.05），高剂量大黄素组变化最明显，见表4。

Tab.3 Comparison of SOD,MDA and GSH-Px levels in lung tissues between five groups表3各组大鼠肺组织SOD、MDA、GSH-Px水平比较（n=12，±s）

Tab.3 Comparison of SOD,MDA and GSH-Px levels in lung tissues between five groups表3各组大鼠肺组织SOD、MDA、GSH-Px水平比较（n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，c与低剂量组大黄素组比较，d与中剂量大黄素组比较，P＜0.05

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Tab.4 Comparison of miR-34a,SIRT1 mRNA and protein levels in lung tissues between five groups表4各组大鼠肺组织miR-34a、SIRT1 mRNA及蛋白水平比较 （n=12，±s）

Tab.4 Comparison of miR-34a,SIRT1 mRNA and protein levels in lung tissues between five groups表4各组大鼠肺组织miR-34a、SIRT1 mRNA及蛋白水平比较 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，c与低剂量组大黄素组比较，d与中剂量大黄素组比较，P＜0.05

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2.5 各组大鼠肺组织SIRT1蛋白表达水平比较 与假手术组相比，模型组大鼠肺组织SIRT1蛋白水平显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，中、高剂量大黄素组大鼠肺组织SIRT1蛋白水平显著增高（P＜0.05），高剂量大黄素组增高最明显，见表4、图2。

Fig.2 Protein expressions of SIRT1 in lung tissues of five groups of rats图2 各组大鼠肺组织SIRT1蛋白表达情况

3 讨论

本研究首先采用气管滴加肺炎链球菌感染法制备肺炎大鼠模型，结果显示，模型组大鼠肺泡塌陷，有大量炎性细胞浸润，且肺组织TNF-α、IL-6水平显著增加，TNF-α、IL-6均为促炎因子，机体感染肺炎链球菌后，巨噬细胞活化产生大量TNF-α、IL-6，共同促进肺组织炎症进展，提示模型制备成功，可用于后续研究。大黄素别名朱砂莲甲素，化学式C15H1005，是从大黄根茎中提取的主要有效单体活性成分。现代医学研究表明，大黄素具有广谱抗微生物、抗炎、抗氧化应激等多种药理学作用［12-13］。Zhong等［14］研究报道，大黄素可抑制肠道病毒71复制和调节人胚肺成纤维细胞MRC-5的细胞周期分布。谢璟等［15］发现大黄素可降低肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织TNF-α、IL-6水平，减轻炎症反应，其机制可能与抑制p38 MAPK mRNA及蛋白表达有关。本研究结果显示，与模型组比较，中、高剂量大黄素可显著减轻肺炎大鼠肺组织炎症反应及TNF-α、IL-6水平，其中高剂量大黄素组效果最优，提示大黄素可能对肺炎链球菌性肺炎有一定治疗作用。

本研究结果亦显示，与假手术组比较，模型组大鼠肺组织SOD、GSH-Px水平显著降低，MDA水平显著增高。正常生理情况下，机体内氧自由基及活性氧的生成及清除处于动态平衡，炎症、病原微生物感染、缺血/再灌注等均可导致机体活性氧生成远大于机体清除能力，引起组织或细胞氧化应激损伤［16］。MDA是膜脂过氧化重要产物之一，可加剧膜损伤，SOD、GSH-Px均是体内重要抗氧化物金属酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起重要作用；而大黄素可显著提高肺炎大鼠肺组织SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平，提示大黄素可抗肺炎链球菌感染引起的肺组织氧化应激损伤。miR-34a是一种与氧化应激反应有关的miRNA，SIRT1是一种去乙酰化酶，可调控细胞增殖、代谢，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种功能。多项研究表明，miR-34a与SIRT1存在直接靶向调控关系，抑制miR-34a表达，可激活SIRT1表达，有效抑制血管、糖尿病性血管内皮细胞、肝组织等氧化应激损伤及炎症反应［17-19］。Zhang等［20］研究报道，大黄素可保护心肌细胞H9c2免受缺氧损伤，可能与上调miR-138表达，激活SIRT1/AKT和Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠肺组织miR-34a表达水平显著增加，SIRT1 mRNA及蛋白水平显著降低，而大黄素可显著降低模型大鼠肺组织miR-34a表达水平，增加SIRT1 mRNA及蛋白表达，提示大黄素减轻肺炎链球菌肺炎大鼠氧化应激损伤可能与抑制miR-34a表达，促进SIRT1表达，进而调控miR-34a/SIRT1轴有关。

综上所述，大黄素可减轻肺炎链球菌大鼠炎症反应及氧化应激损伤，可能与调控miR-34a/SIRT1轴有关。但关于miR-34a与SIRT1在肺炎大鼠中具体调控关系及大黄素对该信号轴的直接还是间接调控作用尚未知，有待后续深入研究。