高脂饮食通过胰腺Pax6信号通路诱导妊娠大鼠胰岛素抵抗的机制

邓棋芳

广东省深圳市龙华区人民医院产科 518110

伴随着妊娠期糖尿病(GDM)与妊娠预后关系研究的不断深入，关于妊娠期糖尿病(GDM)的诊断标准逐渐降低，妊娠期糖尿病的发病率进一步提升[1-2]。妊娠期糖尿病孕妇的血糖如果不能得到控制不仅会对胎儿生长发育造成不良影响，而且也会对后期的成长造成很多长期影响，例如成年期2型糖尿病的发病率会明显提升[3-4]。妊娠期糖尿病的发生与遗传、生活方式等很多因素具有直接关系[5]。近几年研究发现，不良的生活方式是造成妊娠期糖尿病发病率提升的关键因素，比如过多的妊娠期热量摄入、较低的体力活动会引发妊娠期体重过多增加等[6-7]。孕妇营养过剩对血糖、胰岛素水平以及合成不足等所致影响及机制暂未明了。因此有必要阐明胰岛β细胞在妊娠并血糖升高时的功能及分子机制[8-9]。胚胎期中枢神经系统和胰腺的发育与配对盒因子6(Pax6) 的转录因子具有明显的相关性。在鼠胰腺组织内分泌细胞中可见Pax6的表达[10]。根据研究发现，小鼠胰腺α细胞分泌胰高血糖素中，Pax6的表达具有重要作用[11]。目前的研究发现，胰岛β细胞功能、胰岛素生物合成均有Pax6的参与[12]。为了研究高脂饮食对妊娠大鼠胰岛β细胞功能及Pax6信号通路表达的影响，通过给妊娠大鼠进行高脂高热量饮食，从而建立了妊娠大鼠糖耐量及胰岛素抵抗损伤模型。从而为妊娠期高脂肪饮食致孕妇高血糖，或 GDM的发病提供理论支持，予以报告。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及其环境：8周龄雌性Wistar 未妊娠大鼠(健康清洁级)60只，体重：150～180g之间，20只雄性8周龄Wistar大鼠，体重：160～200g之间，购买于上海斯莱克有限公司。饲养条件：室温为(22.0±1.0)℃，湿度为40%～60%，饮水自由，昼夜交替12h。

1.1.2 分组和饲料：进行适应性喂养1周后根据雌雄3∶1的比例进行合笼，于第2天晨8时对各笼雌鼠予以棉签涂取阴道栓，镜下予以观察，载玻片上出现3处不同视野精子记为阳性，并作为妊娠第1天(d1) 进行记录，未检测到3处不同视野精子的雌鼠继续予以合笼饲养，2周后，仍未妊娠的大鼠则进行放弃。妊娠第1天对大鼠体重进行测量，随机分组: 高脂肪饮食组和对照组，每组30只。两组大鼠均进行自由进水。普通饲料量配比为脂肪12.8%，糖类61.5%，蛋白质25.7%；高脂饲料糖类及脂肪分别为 40%，蛋白质20%。在-20℃冰箱内保存高脂饲料，普通饲料予以常温环境保存。

1.2 方法

1.2.1 饲养及称重：饲养期间，每天均需对大鼠精神状况、活动、毛色及饮水进食情况观察。合笼期间必须每天清晨对托盘内阴道栓情况观察；每天记录妊娠期间大鼠的食量，每隔2d记录大鼠体重。

1.2.2 空腹血糖以及血清胰岛素检测：妊娠第2天(d2)及第20天(d20) ，大鼠的一般孕期为20～22d， 妊娠大鼠需要夜间禁食12h，第2天上午6—8点予以眼眶后静脉丛取血1ml， 并对其空腹血糖(Fasting blood glucose concentration，FBG) 进行检测(罗氏卓越型血糖仪及试纸)，取血静置1h后低温离心(4℃，5 000r/min，15min)，获取上清。 将血清在-80℃的条件下冷藏，之后采用双抗体夹心 ELISA 法对空腹胰岛素水平(Fasting seruminsulin concentration，FINS)进行检测。并对胰岛素敏感指数(ISI)及HOMA模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) 进行计算。ISI=1/(FBG×FINS);HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3 葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test，OGTT)和胰岛素释放试验(Insulin release test，IRT):妊娠第20天取血进行 FGB、FINS的检测后，根据2.0g/kg体重采用50%葡萄糖进行灌胃，在葡萄糖负荷后的0、15、30、60min，分别对大鼠尾静脉取血约0.5ml并对血糖及血清胰岛素水平测定。

1.2.4 标本取材:妊娠第20天取血后，颈椎脱臼处死后开腹获取胰腺组织，试验需在冰上进行，接触组织的器械都需要进行无 RNA 酶处理，之后分别取3～5mm放到无 RNA 酶的 EP 管中，采用液氮速冻，保存在-80℃冰箱。

1.2.5 Western blot检测相关蛋白的表达:取液氮冻存好的胰腺组织，将其研磨成粉末，进行充分裂解30min后，在4℃的条件下进行12 000×g离心30min，提取上清。应用BCA蛋白活性测定将30μg蛋白进行10% SDS-PAGE，将电泳分离好的蛋白转移到硝酸纤维素膜(PVDF)上，在室温条件下在5%脱脂牛奶中进行反应1h，进行充分洗涤后分别添加一抗小鼠抗人胞Pax6单克隆抗体(1∶1 000)兔抗鼠Pdx1多克隆抗体(1∶1 000)以及兔抗人MafA单克隆抗体(1∶1 000)后，在4℃的条件下反应过夜，进行充分洗涤后添加二抗辣根过氧化物酶(HRP) 标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000) 或辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，在室温条件下反应30min，进行充分洗涤后，采取ECL化学发光液反应1min，采用全自动数码凝胶图像分析系统进行拍照观察。

2 结果

2.1 高脂饮食对妊娠大鼠孕期体重影响 高脂饮食组大鼠孕期体重高于同期对照组大鼠，且高脂饮食组大鼠妊娠第13 天、19天体重均明显高于同期对照组，具有显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体重变化比较

2.2 高脂饮食对妊娠大鼠的 FBG、FINS的影响 大鼠妊娠第 20 天时， 高脂饮食组妊娠鼠的 FBG明显高于对照组，具有显著性差异(P<0.05)，且产生高血糖症状；高脂饮食组妊娠鼠的FINS与对照组进行比较，无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 高脂饮食对妊娠大鼠的FBG、FINS的影响

2.3 高脂饮食对妊娠大鼠的ISI、HOMA-IR水平的影响 对高脂饮食对妊娠大鼠的ISI、HOMA-IR的影响的研究发现，大鼠妊娠第20天时， 高脂饮食组妊娠大鼠的HOMA-IR明显高于对照组，具有显著性差异(P<0.05)。而高脂饮食组妊娠大鼠ISI与对照组进行比较，则不具有显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 高脂饮食对妊娠大鼠的 FBG、FINS的影响

2.4 高脂饮食对不同时间段妊娠大鼠OGTT的影响妊娠 对高脂饮食对不同时间段妊娠大鼠OGTT的影响进行研究发现，大鼠妊娠第20天时，高脂饮食组妊娠大鼠OGTT各时间点的血糖值均明显高于对照组，具有显著性差异(P<0.05)。见表4。

表4 高脂饮食对不同时间段妊娠大鼠OGTT的影响

2.5 高脂饮食对不同时间段妊娠大鼠IRT的影响 IRT的试验结果发现，高脂饮食组妊娠大鼠0min、15min、30min、60min时间点胰岛素释放水平均低于对照组，15min、30min、60min时统计学差异明显(P<0.05)。见表5。

表5 高脂饮食对不同时间段妊娠大鼠 IRT 的影响

2.6 高脂饮食对妊娠大鼠胰腺Pax6蛋白及其相关蛋白表达的影响 高脂饮食对妊娠大鼠胰腺 Pax6蛋白及其相关蛋白表达的影响研究表明，在妊娠晚期(d20)，高脂饮食组妊娠大鼠胰腺 Pax6蛋白及其相关蛋白Pdx1、MafA的表达均明显低于对照组，具有显著性差异(P<0.05)。见表6及图1～3。

图1 蛋白质印迹法检测妊娠大鼠胰腺 Pax6表达水平

表6 高脂饮食对妊娠大鼠胰腺 Pax6 及其靶基因表达的影响

3 讨论

最近国内外专家的研究发现，在妊娠期糖尿病的发病中，饮食因素具有十分关键的作用[13-14]。很多研究人员从营养因素进行探索，希望可以发现预防妊娠期糖尿病发生、抑制妊娠期糖尿病发展并缓解妊娠期糖尿病结局的最好方法[15]。目前研究发现，胰岛β细胞功能损伤与GDM的发生具有直接关系，β 细胞的分化以及功能会受到很多转录因子调节，如Pax4、Pdx1、MafA、Pax6 等，目前这些转录因子之间存在的联系已经在动物实验中得到证明[16-17]。Kanwar P等研究示：敲除 Pax6鼠胰腺内分泌细胞的个数虽然没有显著改变，但鼠内分泌功能会受到严重损伤[18]。对于维持胰岛细胞功能，尤其是α和β细胞的分化，Pax6具有关键的意义。Pax6基因在小鼠胰腺发育的早期及成熟的内分泌细胞中大量表达，研究表明对胰腺α细胞的分化，Pax6基因的表达十分关键[19]。并且最近的研究发现，Pax6 对β细胞关键基因编码蛋白的转录可进行调控，从而影响胰岛素生物合成及释放。Pax6也能够特异性的调控与胰岛素基因转录的主要蛋白的表达[20]。胰十二指肠同源盒因子1(Pancreatic and duodenal homeobox factor-1，Pdx1) 能参与胰腺早期发育及成熟期β细胞分化。Pdx1在成熟的机体内可以通过很多蛋白的表达，从而调节β细胞功能，特别是对胰岛素及胰岛素相关基因进行调节[21]。在血糖调控胰岛素蛋白表达的过程中，MafA具有重要作用，葡萄糖浓度能够调控MafA的表达水平以及功能。MafA在糖尿病的状态下，其表达量会出现减弱，从而对胰岛素的合成和分泌造成影响。目前的研究发现，MafA基因缺陷小鼠的Pdx1和GLUT2的蛋白表达水平都出现降低，说明MafA是葡萄糖刺激下胰岛素分泌的一种重要调控蛋白[22]。

图2 蛋白质印迹法检测妊娠大鼠胰腺 Pdx1表达水平

图3 蛋白质印迹法检测妊娠大鼠胰腺 MafA表达水平

实验对妊娠期大鼠应用高脂肪饮食喂养，诱导产生糖耐量异常及胰岛素抵抗，这种防范已经广泛应用于2型糖尿病动物实验，并证明高脂饮食可诱发2型糖尿病。同时发现在妊娠晚期(d20)，高脂饮食组FBG、HOMA-IR明显高于对照组，OGTT、IRT也有不同程度异常，Pax6蛋白及其相关蛋白Pdx1，MafA的表达均明显下降。推测机体在高血脂以及高血糖的情况下，Pax6属于基因转录调节的关键因子。

综上所述，对妊娠期大鼠高脂及高热卡饮食致其产生糖耐量异常以及胰岛素抵抗，推测是由Pax6蛋白及其相关蛋白Pdx1、MafA表达变低所导致，从而在一定程度上揭示了孕妇孕期营养过剩容易发生妊娠期糖尿病的机制。本研究可为妊娠期孕妇营养膳食提供理论依据，为妊娠期糖尿病以及具有高危风险的孕妇提供合理膳食指导，因国内外对此研究较少，其机制和后续信号通路还需要进行下一步的研究验证。