PCR技术及其在食品微生物检测中的应用探讨

丁 磊 田 虎 柳吉芹

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引言

PCR技术在食品微生物的检测当中有着十分广泛的应用。该方法能够实现对于目标微生物的精确筛选，并能够鉴定食品当中的微生物种类。PCR技术能够对老百姓切实关心的食品安全问题提供技术手段。通过PCR技术能够为百姓餐桌提供食品当中的微生物指标检测依据，该技术在食品安全方面的应用能够提高对于微生物指标检测的效率和质量。

一、PCR原理与技术

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术的工作原理是根据DNA模板当中的特性进行模仿并复制。在一定的条件之下，以单链DNA作为模板进行复制的过程当中，利用人工合成的寡核苷酸作为引物，或者是根据实验要求制定适合的寡核苷酸作为引物。还能够有效利用耐热DNA聚合酶促使该复制过程的完成。在整个复制过程当中，通常会用到20～40个PCR循环。每一个PCR循环当中都会分为三个步骤进行工作。高温变性、低温再生、适当温度扩展，每一部分当中PCR都会进行对应的工作，从而保证DNA能够得到有效复制。在高温环境之下，随着DNA的变性，氢键就能够被打开，让双链变为单链。在低温条件之下，寡核苷酸引物以其自身的特异性互补并联结单链DNA模板，促使DNA再生。适当温度当中PCR循环也在进行着工作。DNA聚合酶以单链DNA作为模板，沿着规定的方向进行运动，除此之外，还能够在不同的方向中插入核苷酸，使相关引物延展合成模板的互补链。经过多样化的变性再生与扩展，PCR循环不断完成自身工作，有效扩展着DNA片段[1]。

引物:引物是PCR工作过程当中所需要运用的物质之一。想要成功的扩增DNA片段其两侧互补的寡核苷酸就需要引物在之间作为连接的桥梁。引物自身具有一定的特殊性，也正是因为自身的特殊性引物才能够通过PCR反应过程扩增特异性。除此以外，引物的设计以及合成的质量都对PCR扩增有着最为直观的影响。在正常情况下，引物应当位于要分析的DNA组当中最为保守的区域，一般引物的长度大概为15～30个碱基。由于引物之间不能够进行互补，每个引物当中的碱基都不能够过分的重复连续。不仅如此，自身的发夹结构也不能由引物构成。引物当中的特定tm值应尽量接近以及GC含量不能过高。

dNTPs:dNTP是4个核苷酸的混合物，是PCR反应所需的底物。当四个核苷酸的浓度相同时，核苷酸在PCR工作循环当中的掺入错误率可以降级到最小化。一般来说，dNTP在浓度为0.2mol/L时能够更好的完成扩增片段的长度以及碱基组成的确定[2]。

DNA聚合酶:当前，用于PCR扩增的最常用的DNA聚合酶是Thermus aquaicus生产的TagDNAase，它具有出色的热稳定性，可以承受94摄氏度的高温，并且在该温度下很短。最佳反应温度为72摄氏度，在70摄氏度时催化核酸链扩展的速率为2800个核苷酸/分钟。通常，在100l反应系统中通常会使用两个单位DNA聚合酶，所使用的DNA聚合酶数量对PCR扩增效率以及其特异性都有着十分重要的影响。PCR技术正在持续发展过程当中，除了tag DNA聚合酶之外，耐热PFU DNA聚合酶已经能够广泛应用到PCR反应当中。PFU DNA聚合酶是一种在高温环境之下成年热球菌产生的DNA聚合酶。到目前为止，这是耐热性DNA聚合酶的最高速率，但扩增速率比TagDNA聚合酶低550个核苷酸/分钟。此外，还使用了r Tth DNA聚合酶，为了能够让DNA模板能够在PCR反应当中顺利进行扩增，在进行扩增反应之前需要对相对应的RNA片段进行逆转录。r TthDNA聚合酶可以结合逆转录和聚合反应。一种可在RNA逆转录后直接扩增大量DNA片段的片段，大大减少了操作步骤并提高了效率[3]。

缓冲液:目前最为常用的PCR缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl(p H 8.3-8.8)系统。每种Tag酶都有相同的反应缓冲液，因此通常不建议将该缓冲液与其他制造商的Tag酶交叉使用。

Mg+:Mg+其浓度明显影响PCR产物的特异性和产量，Mg+可以与阴离子(阴离子基团如磷酸盐)进行结合，在PCR反应系统中，从引物、DNA模板或d NTPs当中都能够获得磷酸盐，因此应选择适当的Mg+以达到最佳反应效果，浓度通常为2-5mmol/L。

核酸模板:核酸模板是PCR反应当中的重要组成部分之一。PCR反应的过程当中，一般都利用细菌进行，一般的反应模板来源DNA是染色体或质粒。使用染色体的DNA作为模板的PCR扩增过程当中，所需要的标记酶数量相对较大，对于模板DNA的纯度要求会更高。并且在反应的过程当中不会存在抑制性的DNA聚合酶活性蛋白酶。通常，PCR反应系统所需的模板量是目标序列的102-105拷贝。

二、将PCR技术应用于食品微生物检测

(一)用于检测食品样本中的致病菌。传统微生物检测方法步骤繁琐且费时费力，首先，必须将样品浓缩并培养以检测微生物，并且只有在样品达到可检测水平后，才能分离微生物，观察形态学特征并进行生化鉴定。而且，常规样品不能检测难以手动生长的微生物。在所有细菌环境当中，编码rRNA的基因处于一种高度保守的状态，因此可以用PCR方法扩增其DNA片段，从而更加快速敏捷的对样品进行检测。值得一提的是，对检测那些无法进行人工操作培养的细菌或者病原体微生物，PCR方法的优势体现的更加明显。想要让PCR反应能够更好的为食品检测服务，就需要在准备过程当中，提取出一定的目标DNA。凭借离心或者是过滤的方式进行相应的细胞获取，之后对其进行裂解，然后对得到的裂解细胞进行核酸的纯化。使其适合于PCR反应。[4]。也可以直接将样品中的细菌细胞进行裂解来得到核酸。

(二)用于检测饮用水中的指示菌。水质测试基于对大肠杆菌的检测。常规的检测方法是培养革兰氏阴性细菌和可以使用乳糖的细菌的方法，并且该检测方法很复杂并且需要几天的时间。然而，一些大肠杆菌菌株不表达-葡糖醛酸糖苷酶，因此有时会出现检测失败。PCR技术为检测-半乳糖苷酶(lac)和-葡萄糖醛酸苷酶(uid)基因提供了更加灵敏的方式。lacZ和uid A基因的在进行PCR扩增的过程当中，分别需要对水样当中的大肠菌群和大肠杆菌进行检测。通常，扩增的lacZ同样适用于同类型的生物进行选择性的培养办法，而扩增的uid A可以检测大肠杆菌和瞪羚物种。因此，PCR方法更加灵敏。此外，在使用水源之前使用PCR检测细菌更为安全，因为PCR反应可在数小时内完成。

(三)用于检测和鉴定乳酸菌。通过比较32种现有双歧杆菌和相关物种的16S rRNA基因的序列，不难发现，寡核苷酸序列通常位于1412到1432位。这样的发现在所有双歧杆菌当中都是同样存在的，这一寡核苷酸序列可以作为双歧杆菌进行特定的寡核苷酸片段。这一特定的寡核苷酸片段可以作为扩增双歧杆菌16SrRNA基因片段进行PCR反应的引物。在进行反应时通常采用简单的形式，用SDS进行细菌细胞的裂解，之后利用蛋白酶k作为去除多余蛋白质的作用物，以此获得样板DNA。在该条件下，双歧杆菌都可以通过PCR扩增技术实现其模板复制、扩增，从而产生典型的1.35kb的核苷酸片段，该类型的片段只有双歧杆菌产生，其他的细菌则不会产生该条带。因此双歧杆菌可以利用PCR技术进行检测、鉴定和分类乳酸菌。

三、结束语

简而言之，由于PCR技术可以快速，特异性地扩增所需的DNA片段和靶基因，在很多领域当中都发挥着十分重要的作用。尤其在近期发生的新冠肺炎疫情中，PCR技术在检测新型冠状病毒核酸领域也发挥着重要的作用。这也就是为什么PCR技术的发展会得到社会各界的广泛关注。