氧化应激介导的DNA损伤在大鼠心肌H9C2细胞缺氧/复氧损伤中的作用*

骆佳铭，李 机，赵 伟

(南方医科大学珠江医院麻醉科，广州 510282)

心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是围术期面临的一种常见病理生理变化，严重威胁患者生命安全[1-2]，其发病机制仍不清楚。前期研究表明MIRI是多种因素共同作用的结果[3-4]，在急性心肌缺血再灌注状态中氧化应激发挥了显著破坏作用[5-6]。当发生心肌缺血再灌注时，活性氧(reactive oxygen species,ROS)暴发超过了机体捕获清除的能力时可破坏细胞膜结构的完整性，造成MIRI。氧化应激是如何导致MIRI后心肌细胞损伤和死亡，至今尚不明确。

相关研究表明，氧化应激是导致细胞DNA损伤的重要因素之一[7]。DNA 作为生物体最重要的遗传物质，其稳定性决定了生物的生存和发展。但生物体本身基因的完整性容易受内、外环境因素影响，辐射线的伤害或化学试剂的破坏均可导致DNA 的双键结构断裂而造成损伤。前期研究发现，MIRI过程中心肌细胞内ROS水平增高[6,8-9]。由此推测，MIRI病理过程中氧化应激产生的ROS很可能是导致心肌细胞DNA损伤的重要因素。

本研究在大鼠心肌H9C2细胞缺氧/复氧模型上检测细胞内氧化应激导致的DNA损伤，并通过加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)论证由氧化应激导致的DNA损伤在MIRI发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌H9C2细胞购自中科院上海细胞库(目录号GNR 5)；一抗Bcl-2(货号：#3498)、Bax(货号：#1479)、Cytochrome c(货号：#12963)、Phospho-Histone H2A.X (S139)(货号：#9718S)和β-actin(货号：#4967)抗体购自美国CST公司；8-OHdG(货号：#sc-66036)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

大鼠心肌H9C2细胞是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，由于来源于心脏，常作为心脏成肌细胞用于心肌疾病的研究。将H9C2细胞置于含有10% FBS 100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素的 DMEM培养液中，37 ℃ 5% CO2细胞孵箱培养，培养液每 2天换1次[10]。

1.2.2建模和分组

将正常培养的 H9C2细胞分成4组。对照组(Con组)：37 ℃ 5% CO2培养箱中正常培养；缺氧/复氧模型组(H/R组)：在37 ℃ 5%CO2培养箱中培养24 h后换液，细胞长至80%后将细胞用PBS冲洗，加入不含血清的低糖DMEM，置入85%N2、10%H2、5%CO2的37%饱和湿度厌氧培养箱，分别缺氧培养6 h，加入新鲜DMEM培养基，置于5% CO2培养箱中继续复氧培养12 h[11]；抗氧化剂NAC组(NAC组)：仅在培养基中加入终浓度为1 mmol/L抗氧化剂NAC，不进行缺氧/复氧处理[12]；抗氧化剂+模型组(NAC+H/R组)：缺氧/复氧前1 h在培养基中加入终浓度为1 mmol/L抗氧化剂NAC预处理，再进行缺氧/复氧处理。

1.2.3Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达

取各组处理后的H9C2细胞，以预冷的 PBS洗涤 3次后加入100 μL含10% PMSF和5%磷酸酶抑制剂的细胞裂解液(使用前5 min 配置)，低温离心取蛋白上清液后进行蛋白定量；上样后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳完成后再用200 mA恒定电流进行0.22 μm PVDF转膜90 min，封闭2 h，继续孵一抗过夜，TBST缓冲液清洗 3次，室温下孵二抗1 h，TBST清洗3次，化学发光仪进行检测。Image J软件分析照片中蛋白条带的吸光度(A)值，计算目的蛋白相对表达水平。

1.2.4细胞免疫荧光检测ROS水平、DNA损伤、细胞损伤情况[13]

H9C2细胞接种于6孔培养板的细胞爬片上。各组处理后，PBS漂洗2次,10 mmol/L的DCFH-DA染液于37 ℃孵育30 min，DAPI 37 ℃复染细胞核10 min。随机选取5个视野用荧光显微镜采集照片。

经过分组处理后，PBS清洗细胞爬片3次，4%的多聚甲醛的固定10 min，放入含0.1% Triton X-100的PBS中室温孵育15 min。PBS清洗3次，分别加入目的抗体4 ℃过夜；次日PBS清洗3次，分别采用对应荧光二抗室温孵育1 h，PBS 清洗3次，加入1 μg/mL DAPI 37 ℃复染细胞核10 min；加抗淬灭封片剂盖上盖玻片，荧光显微镜下观察并拍照记录。Image J软件分析各样品的平均荧光强度。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组细胞氧化应激ROS水平

与Con组比较，H/R组细胞内ROS水平升高(P<0.05)；与H/R组比较，NAC+H/R组ROS水平明显降低(P<0.05)，见图1。

图1 各组细胞ROS水平

2.2 各组DNA损伤、细胞损伤情况

与Con组比较，H/R组细胞p-γH2ax、8-OHdG、Cytochrome c表达增多(P<0.05)；与H/R组比较，NAC+H/R组细胞p-γH2ax、8-OHdG、Cytochrome c表达明显降低(P<0.05)，见图2、3。

A:各组荧光显示图；B:p-γH2ax；C：8-OHdG。

图3 各组细胞损伤情况

2.3 各组细胞凋亡情况

与Con组比较，H/R组细胞Bax/Bcl-2表达增加(P<0.05)；与H/R组比较，NAC+H/R组细胞Bax/Bcl-2表达减少(P<0.05)，见图4。

A:Western blot；B:Bax/Bcl-2。

3 讨 论

MIRI是多种因素共同作用的结果，当发生心肌缺血再灌注时，ROS通过心肌细胞和内皮细胞的一系列相互作用途径暴发性产生[14]，并成为缺血后损伤的关键机制。当心肌发生缺血或梗死时，细胞内氧自由基的形成增加，同时抗氧化系统受到限制，O2-和H2O2的清除减少，使氧自由基转变成最强的-HO，超过了机体捕获清除的能力[15]。ROS可攻击生物膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，破坏心肌细胞膜结构完整性，最终造成MIRI。另外，氧化应激可通过上调细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2来引发细胞损伤。可见氧化应激在心肌细胞凋亡和损伤过程中起着至关重要的作用，它们参与了MIRI的发病机制。因此，ROS的产生是决定心肌损伤严重程度的重要因素。

DNA 作为生物体最重要的遗传物质，对正常情况下不可再生的心肌细胞来讲尤为重要[15]。相关研究表明：氧化应激是导致细胞DNA损伤的重要因素之一[16]。MIRI过程中ROS产生过多或 DNA损伤未能修复，将对心肌造成不可逆的损伤[17]。此外，既往研究发现，当机体发生DNA损伤后会激活细胞周期“防火墙”，可暂时阻滞细胞周期的进展，而且还会激活相关的修复通路对损伤的DNA进行修复，如果DNA损伤无法完全被修复，则会引起细胞凋亡甚至坏死[18]。本研究显示，大鼠心肌细胞经过缺氧/复氧处理后，细胞内ROS水平升高，DNA损伤明显加重，凋亡增多。而之前的研究也有类似报道，MIRI病理过程中氧化应激产生的ROS很可能导致心肌细胞的DNA 损伤[19]。

因此，寻找一个心脏保护剂和抗氧化剂来调节ROS水平进行预处理，对改善心脏功能和延缓心肌坏死具有重要的临床意义[4,6]。最近，基础研究提供了心肌缺血和再灌注期间ROS形成的直接证据，一些临床前和临床研究也已经证明抗氧化剂的潜在心脏保护价值[20-22]。NAC作为一种含有巯基的抗氧化剂，它能干扰ROS、清除自由基。有研究报道NAC可通过减少自由基的产生，拮抗 ROS介导的大鼠 H9C2心肌细胞凋亡[23]，与本研究结果一致。临床上，NAC是极具研究价值且用途广泛的药物，其在治疗慢性肝损害、呼吸系统疾病、神经退行性疾病、艾滋病和心功能损伤等疾病方面均取得了较好的疗效。然而，NAC是一种非特异性的抗氧化剂，它不能针对性地降低具有破坏性的氧化因素，甚至可能干预到正常的生理水平的氧化功能。笔者加入终浓度为1 mmol/L抗氧化剂NAC，结果显示NAC组与Con组细胞内ROS水平、DNA损伤均无明显差异。如果明确加重MIRI过程中氧化应激的种类，进行有针对地干预清除而保留生理功能的氧化水平将会极大地发挥该类抗氧化剂的治疗效果[4]，后续研究将以此为侧重点。

综上所述,氧化应激介导的DNA损伤可能密切参与MIRI的发病过程，抗氧化剂NAC可明显减少氧化应激心肌细胞的DNA损伤和凋亡，从而减轻MIRI。