产黄原胶微生物的筛选和高产菌株的选育

李泓萱 张思雨 崔鹏飞 李 想 刘若寒 张彩凤

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

黄原胶用途非常广泛，常被用作增稠剂、悬浮剂、乳化剂和稳定剂，应用于食品、陶瓷、医药、化妆品、纺织、药品等多种行业，市场发展前景非常可观。

1 材料与方法

1.1 试验材料。腐烂的紫甘蓝；牛肉膏固体斜面培养基；发酵培养基：玉米淀粉12 g，蔗糖45 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，CaCO33 g，MgSO40.1 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，蒸馏水1 000 ml，pH 值7.0。

1.2 试验菌株筛选。采样(从腐败的紫甘蓝上取样)→营养琼脂增殖培养→TTC 影印法，从营养琼脂挑取TTC 对应缺失的黄褐色单菌落→接种酵母膏、半乳糖、碳酸氢钙琼脂→挑取形成褐色水溶性色素的单菌落，并纯化→检测纯化产物黄原胶。

1.3 黄原胶的发酵生产

1.3.1 种子培养液培养。挑取菌种活化传代几次，接种于装有100 ml 种子液的500 ml 三角瓶中，28 ℃、200 r/min 恒温摇床培养24 h。

1.3.2 摇瓶发酵。将发酵培养基中按接种量4%接入种子液，32℃旋转式摇床200 r/min，发酵72 h，即得到黄原胶发酵液，碳源的起始浓度一般以2%～4%为好。

1.3.3 纯化黄原胶。发酵液中加入蛋白酶，破坏细菌细胞壁，使菌体进行裂解，然后进行过滤离心，使固液分离。再通过醇沉淀法沉淀分离，当醇浓度为60%～70%时，会使黄原胶相互凝集，形成沉淀并与水分开，此时进行黄原胶的提取分离。

1.4 诱变育种。将黄单胞菌菌株进行平板涂布筛选，筛选出直径最大的作为诱变育种的出发菌株。在紫外线照射的环境下，打开培养皿，设计照射时间分别为40 s、80 s 和120 s，设计紫外照射距离分别为20 cm、30 cm 和40 cm。

1.5 黄原胶的纯化提取。通过对诱变结果观察对比，淘汰生长相对迟缓和菌落较小的黄单胞菌株，选取几株生长速度较快的菌株再进行摇瓶发酵，得到发酵液，再通过提取黄原胶，并测定其黄原胶产量。取200 ml 发酵液置于离心管中，向发酵液中添加5 g 的CaCl2，在发酵液温度65 ℃、pH 值5.5 的条件下添加蛋白酶1 万U，酶解3 h；在发酵液温度40 ℃，pH值9.5 的条件下，添加溶菌酶1 万U 并维持6 h，酶解全部完成后灭酶醇提，称量其干重。并与标准菌株进行对比，得到高产的正突变菌株。相对提取率(%)=突变株黄原胶回收量/对照株黄原胶回收量。

2 结果与分析

2.1 菌种的获得与培养。经增殖和选择培养分离到菌株，菌落形态和生理生化鉴定结果符合黄单胞菌属特征。试验得到菌种生长曲线(图1)。由图1 可看出，适合黄单胞菌的生长温度为20 ℃～35 ℃，40 ℃时黄单胞菌基本停止生长，60 ℃为它的致死温度。

图1 发酵菌种的生长曲线

2.2 诱变菌株的获得。按设计的紫外照射时间和工作距离进行诱变试验，计算不同条件下的活菌数。与对照野生菌对比可计算得到致死率。不同诱变时间和诱变距离下的诱变效果如表1 和表2所示。根据试验结果，致死率在70%左右时，紫外线诱导菌株产生正突变的效果最好，选择紫外照射时间为80s；在照射距离为40cm时，致死率最低，最终选择照射的距离为40cm。

表1 不同诱变时间下的致死效果

表2 不同诱变距离下的致死效果

2.3 黄原胶的纯化提取。利用平皿反应选择几株突变菌株进行发酵培养，纯化黄原胶产物，并计算相对提取率。通过试验获得3 株高产菌株，相对提取率如表3所示。与对照株相比，相对提取率分别是155.6%、146.8%和142.5%。

表3 突变株发酵产物黄原胶的相对提取率

3 结论与讨论

通过菌种的获得与培养试验得出，适合黄单胞菌的生长温度为20 ℃～35 ℃，40 ℃时黄单胞菌基本停止生长，60 ℃为它的致死温度。通过紫外线照射诱变试验得出，最佳紫外线的诱变条件是：照射时间80 s，照射距离40 cm。将突变菌株进行发酵培养，纯化黄原胶产物，并计算相对提取率，与对照株相比，相对提取率分别是155.6%、146.8%和142.5%。

因为黄原胶具有稳定、增稠、乳化等作用，所以是目前效果比较好的生物胶。黄原胶以极有特色的理化性质被广泛地用于各种食品的加工生产中。黄原胶可以提高食品的质量，可以使其保质期变长，并且还可以优化感官特性。除此之外，黄原胶还具有热量较低，且不被人体所消化的特点，可作为膳食纤维使用。综上所述，黄原胶具有非常广阔的应用前景。