毛细管气相色谱法测定巴胺磷溶液含量

杨 星，龚旭昊，马秋冉，董玲玲，赵富华，彭文绣，于晓辉

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

巴胺磷是一种有机磷杀虫药，主要通过触杀、胃毒起作用，不仅能灭杀家畜体表寄生虫如螨、蜱，还能杀灭卫生害虫如蚊、蝇等。市场上的制剂有巴胺磷溶液，主要用于驱杀绵羊体表螨、虱、蜱等[1]。巴胺磷溶液作为兽用制剂收载于《兽药质量标准》(2017年版化学药品卷)中，其含量测定方法为填充柱气相色谱法[2]，在如今的检测条件下方法适用性较差，给检验工作带来较大困扰。目前国内外文献主要采用气相色谱-火焰光度检测法、气相色谱-氮磷检测法、气相色谱-串联质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法等方法检测蔬菜、大米、污水、水果、纺织品、豆粕中的巴胺磷残留，针对巴胺磷溶液的含量测定方法的研究未见报道，各国药典也未收载巴胺磷溶液质量标准[3-9]。为了更好地控制巴胺磷溶液的质量，参考气相色谱法的相关文献[10-11]，本研究拟建立毛细管气相色谱-氢火焰离子化检测法测定巴胺磷溶液含量的方法，以期为兽用制剂巴胺磷溶液含量的测定提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 气相色谱仪：美国安捷伦公司，Agilent 7890A，配氢火焰离子化检测器(FID)；电子分析天平：瑞士梅特勒-托利多集团， XS 205，精度0.01 mg。

1.2 试药 巴胺磷对照品来源/批号/含量：农业部环境质量监督检验测试中心/GBW(E)081342/1000.0 μg/mL；邻苯二甲酸二丁酯内标物质来源/批号/含量：上海源叶生物科技有限公司/A22D6L7951/99.8%；巴胺磷溶液规格/批号：40%/20190401、20190402、20190403；色谱级丙酮来源/批号：Fisher/182067。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Supelco SPB-624毛细管柱(固定相：6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷，规格：30 m×0.25 mm×1.4 μm，柱编号：24255)；柱温：240 ℃；进样口温度：250 ℃；检测器(FID)温度：250 ℃；载气：氮气；流速：3 mL/min；进样量：1 μL；分流比：15∶ 1。

2.2 溶液制备

2.2.1 内标溶液的制备 取邻苯二甲酸二丁酯约30 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀(含内标0.6 mg/mL)。

2.2.2 供试品储备液的制备 取供试品约125 mg(约相当于巴胺磷50 mg)，精密称定，置50 mL量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀(含巴胺磷1 mg/mL)。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密量取1 mL巴胺磷对照品(含巴胺磷1 mg/mL)、1 mL内标溶液与2 mL丙酮，混匀(含巴胺磷0.25 mg/mL+内标0.15 mg/mL)。

2.2.4 供试品溶液的制备 精密量取1 mL供试品储备液、1 mL内标溶液与2 mL丙酮，混匀(含巴胺磷0.25 mg/mL+内标0.15 mg/mL)。

2.2.5 系统适用性试验溶液的制备 精密量取(0.8 mL巴胺磷对照品+2.2 mL丙酮、1 mL巴胺磷对照品+2 mL丙酮、1.2 mL巴胺磷对照品+1.8 mL丙酮)，分别与1 mL内标溶液混匀，制成相当于80%、100%和120%的对照品溶液。

2.2.6 线性溶液的制备 精密量取(0.1 mL巴胺磷对照品+2.9 mL丙酮、0.5 mL巴胺磷对照品+2.5 mL丙酮、0.8 mL巴胺磷对照品+2.2 mL丙酮、1 mL巴胺磷对照品+2 mL丙酮、1.2 mL巴胺磷对照品+1.8 mL丙酮、2 mL巴胺磷对照品+1 mL丙酮)，分别与1 mL内标溶液混匀，制成含巴胺磷分别为0.025、0.125、0.2、0.25、0.3、0.5 mg/mL的标准线性系列溶液。

2.2.7 回收率供试品溶液的制备 精密量取(0.5 mL供试品储备液+0.3 mL巴胺磷对照品+2.2 mL丙酮、0.5 mL供试品储备液+0.5 mL巴胺磷对照品+2 mL丙酮、0.5 mL供试品储备液+0.7 mL巴胺磷对照品+1.8 mL丙酮)，分别与1 mL内标溶液混匀，制成相当于80%、100%、120%浓度水平的回收率供试品溶液，每种浓度各配制3份。

2.2.8 定量限溶液的制备 精密量取0.01 mL巴胺磷对照品+3 mL丙酮，与1 mL内标溶液混匀，制成巴胺磷色谱峰信噪比约为10的定量限溶液。

2.2.9 检测限溶液的制备 精密量取4 μL巴胺磷对照品+3 mL丙酮，与1 mL内标溶液混匀，制成巴胺磷色谱峰信噪比约为3的检测限溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 分别精密量取丙酮、2.2.1项内标溶液、2.2.3项对照品溶液、2.2.4项供试品溶液各1 μL，照2.1项色谱条件测定。结果显示，在该色谱条件下，巴胺磷主峰的理论板数大于31000，巴胺磷主峰与内标邻苯二甲酸二丁酯主峰的分离度大于17.0，且与溶剂峰、辅料峰等其他色谱峰均能完全分离，巴胺磷的测定不受干扰，方法专属性强(图1)。

图1 专属性溶液色谱图Fig 1 The chromatogram of solutions for specificity

2.3.2 线性关系考察 分别精密量取2.2.6项标准线性系列溶液各1 μL，照2.1项色谱条件测定。以巴胺磷峰面积与内标邻苯二甲酸二丁酯峰面积的比值(y)为纵坐标，相应巴胺磷浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=3.8151x+0.0048，r2=0.9999，表明巴胺磷在0.025～0.5 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.3.3 重复性试验 精密量取2.2.5项80%、100%和120%的对照品溶液各1 μL，分别进样2次，按内标法计算平均校正因子，RSD为0.6%；取1批巴胺磷溶液，平行制备6份供试品溶液进行测定，计算巴胺磷的含量，RSD为0.6%。结果表明，色谱系统和供试品测定的重复性均良好。

2.3.4 回收率试验 采用加标回收率试验测定准确度。分别精密量取2.2.7项回收率供试品溶液各1 μL，照2.1项色谱条件测定，采用内标法计算测定结果，结果见表1。

表1 巴胺磷添加回收率测定结果Tab 1 The results of the recovery rate ofadded propetamphos

2.3.5 定量限与检测限 以巴胺磷峰信噪比S/N约为10和3的巴胺磷浓度作为定量限与检测限，结果分别为2.5 μg/mL和1.0 μg/mL。

2.3.6 耐用性试验 对该方法进行了流速±0.3 mL/min、柱温±10 ℃、进样口温度±10 ℃、检测器温度±10 ℃、更换不同色谱柱等方面的耐用性考察，结果如表2所示，不同流速、柱温、进样口温度、检测器温度、色谱柱的色谱条件下，巴胺磷理论板数均大于25000，巴胺磷与内标邻苯二甲酸二丁酯分离度均大于15.0，方法耐用性良好。

表2 方法耐用性结果Tab 2 The results of robustness test

2.3.7 溶液稳定性试验 取1份供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h后采集色谱图，考察巴胺磷峰面积、邻苯二甲酸二丁酯峰面积以及两者峰面积比值的变化情况，RSD分别为1.9%、1.9%、0.2%。结果表明，由于采用丙酮作为溶剂，溶液容易挥发，随着放置时间增加，巴胺磷峰面积和邻苯二甲酸二丁酯峰面积逐渐增大，但24 h内两峰面积的比值稳定，不会对测定结果造成干扰。

2.3.8 样品测定 取3批供试品进行含量测定，含巴胺磷分别为标示量的97.3%、97.6%、97.1%，RSD分别为0.6%、0.4%、0.1%。

3 讨论与结论

3.1 色谱柱 《兽药质量标准》(2017年版化学药品卷)中，巴胺磷溶液含量测定方法以非极性的100%甲基聚硅氧烷为固定相，本研究考察了与填充柱相同类型的SE-30毛细管柱、非极性的DB-1毛细管柱、强极性的HP-INNOWAX毛细管柱和中等级性的SPB-624毛细管柱。结果显示，非极性的SE-30、DB-1毛细管柱巴胺磷峰与内标峰的峰型较差，强极性的HP-INNOWAX毛细管柱巴胺磷峰与内标峰不能完全基线分离，中等级性的SPB-624毛细管柱巴胺磷峰与内标峰的峰型对称，两者基线完全分离，适合于巴胺磷的含量测定。

3.2 柱温 经考察，柱温越高，巴胺磷和内标保留时间越小，测定耗时越短，同时巴胺磷峰与内标峰基线能完全分离，但为了避免过高的温度对色谱柱填料造成损坏，柱温不宜超过SPB-624毛细管柱的最大使用温度250 ℃。

3.3 检测器 目前气相色谱用于巴胺磷残留量测定的检测器主要有火焰光度检测器、氮磷检测器和质谱检测器，这些检测器适用于样品中痕量或微量分析，而巴胺磷溶液含量测定为常量分析，氢火焰离子化检测器作为高灵敏度通用型检测器，各实验室配备率高，适用性更强。

3.4 内标法与外标法 采用丙酮作为溶剂，溶液容易挥发，随着放置时间增加，巴胺磷峰面积和内标峰面积逐渐增大。采用外标法测定，测定结果的准确度和重复性容易受到干扰，采用内标法测定，巴胺磷峰与内标峰峰面积随着溶剂挥发同比例变化，不会对测定结果造成干扰。

本研究建立了毛细管气相色谱法测定巴胺磷溶液的含量，该方法操作简便，具有专属性强、快速准确、耐用性好等特点，对现有质量标准中填充柱气相色谱法测定巴胺磷溶液含量进行了改善，适用于巴胺磷溶液含量的质量控制。