产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体大肠杆菌表达条件的优化

朱 真，杜吉革，薛 麒，李启红，印春生，张莹辉，李倩琳，姚文生，陈小云

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)旧称魏氏梭菌(C.welchii)或产气荚膜杆菌(Bacillus perfringens)[1]，1891年，由医学博士Wlliam H. Welch和同事进行尸检时发现。它是一种重要的人畜共患细菌性病原，广泛存在于土壤、污水、食物等自然环境以及动物及人类的肠道中[2]。作为条件致病菌，能引起多种动物，包括绵羊、山羊、牛、猪、禽类、犬、家兔、驯鹿、羊驼等坏死性肠炎、肠毒血症，并能导致人的气性坏疽和食物中毒。菌体自身不致病，依靠其分泌的外毒素造成机体损害[3]，主要分泌α、β、ε、ι四种外毒素，而根据毒素产生种类的不同，该菌可分为A、B、C、D、E五型[2]。由B型和D型产气荚膜梭菌产生的ε毒素[4]，对小鼠的LD50为100 ng/kg，在该菌所有外毒素中毒力最强，也是继肉毒杆菌毒素和破伤风毒素之后的世界第三大毒力细菌外毒素，是潜在的生物恐怖主义战剂，被美国疾控中心(CDC)列为B类生物制剂[5]。

疫苗免疫是防制产气荚膜梭菌病的重要手段，而目前广泛应用的类毒素疫苗存在诸多弊端，如生产过程需添加动物组织、批间差异大、抗原成分复杂、有效抗原含量低。为此，本研究在前期产气荚膜梭菌突变体研究[12]的基础上，对突变体重组蛋白表达条件进行优化，使可溶性表达比例进一步提高，这将为产气荚膜梭菌突变体的进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 pETXm3质粒为本实验室保存； 12%SDS PAGE预制蛋白胶、NuPAGETMMES SDS Running Buffer (20X)、NuPAGETMTransfer Buffer (20X)；BL21(DE3)感受态细胞、IPTG购自宝日医生物技术(北京)有限公司；硫酸卡那霉素购自北京索莱宝科技有限公司；PBS、LB培养基购自北京中海生物科技有限公司；蛋白Marker购自康润生物。

1.2 方法

1.2.1 诱导温度的优化 将pETXm3质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，将成功转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞的菌液分别接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培养过夜，再以1%比例分别接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)5000 mL，37 ℃振荡培养至菌液OD600为0.4～0.6时，加入IPTG(0.5 m mol/L)进行诱导表达，分别取1000 mL菌液，在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃下各振荡培养4 h。各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm离心1 min，弃上清，分别以10 mL PBS重悬沉淀，后使用高压破碎仪进行菌体细胞裂解。分别取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm离心5 min，收集上清，沉淀分别用1 mL PBS复溶。以未诱导菌液裂解液作为阴性对照，取不同温度下诱导的裂解菌液的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，比较不同诱导温度对蛋白表达的影响。

1.2.2 表达菌不同生长期对重组蛋白表达的影响 将成功转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞的菌液分别接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培养过夜，再以1%比例接种于含5000 mL LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃振荡培养，每隔1 h取菌液进行OD600测定，以时间为横坐标，以OD600为纵坐标绘制表达菌生长曲线。同时，分别在培养2、4、6、8 h和10 h各取菌液1000 mL，加入IPTG(0.5 m mol/L)进行诱导表达，37 ℃振荡4 h收获。分别取不同时间点的诱导菌液，4 ℃ 12000 rpm离心1 min，弃上清，分别以10 mL PBS重悬沉淀，后使用高压破碎仪进行菌体细胞裂解。分别取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm离心5 min，收集上清，沉淀分别用1 mL PBS复溶。以未诱导菌液裂解液作为阴性对照，取不同温度下诱导的裂解菌液的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，比较不同生长期对重组蛋白表达的影响。

1.2.3 诱导时间的优化 将成功转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞的菌液分别接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培养过夜，再以1%比例接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)5000 mL，37 ℃振荡培养至菌液OD600为0.895～1.295时，加入IPTG(0.5 m mol/L)进行诱导表达，分别取1000 mL，在37 ℃下振荡培养2、4、6、8 h。各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm离心1 min，弃上清，分别以10 mL PBS重悬沉淀，后使用高压破碎仪进行菌体细胞裂解。各取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm离心5 min，收集上清，沉淀分别用1 mL PBS复溶。以未诱导菌液裂解液作为阴性对照，取不同温度下诱导的裂解菌液的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，比较不同诱导时间对蛋白表达的影响。

1.2.4 IPTG浓度的优化 将成功转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞的菌液分别接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培养过夜，再以1%比例接种于LB肉汤培养基(Kana 30 μg/mL)2瓶，5000 mL/瓶，37 ℃振荡培养至菌液OD600为0.895～1.295时，将2瓶菌液混匀，分别取1000 mL，分别加入浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mM 的IPTG进行诱导，在37 ℃下分别振荡培养4 h后，各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm离心1 min，弃上清，分别以10 mL PBS重悬沉淀，后使用高压破碎仪进行菌体细胞裂解。各取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm离心5 min，收集上清，沉淀分别用1 mL PBS复溶。以未诱导菌液裂解液作为阴性对照，取不同温度下诱导的裂解菌液的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，比较不同IPTG浓度对蛋白表达的影响。

2 结 果

2.1 重组蛋白表达条件优化

2.1.1 诱导温度的优化E.coliBL21(pETXm3)经IPTG在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃条件下诱导表达，从SDS-PAGE电泳图中可得知，目的蛋白主要以可溶表达为主，且37 ℃条件下目的蛋白可溶性表达量最高，故选择37 ℃作为最佳诱导温度。

a.诱导温度对重组蛋白(上清)表达的影响；b. 诱导温度对重组蛋白(沉淀)表达的影响a. Effect of induction temperature on recombinant protein(supernatant)expression；b. Effect of induction temperature on recombinant protein(precipitation)expression；M.蛋白marker；NC1.未诱导菌细胞裂解上清；NC2.未诱导细胞裂解沉淀；1/2/3/4. 17/22/27/32/37 ℃诱导细胞裂解上清；6/7/8/9. 17/22/27/32/37 ℃诱导细胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane NC2. The precipitation of cell lysateswithout induction；Lane 1/2/3/4. The supernatant of cell lysates induced under 17/22/27/32/37 ℃；Lane 6/7/8/9. The precipitation of cell lysates induced under 17/22/27/32/37 ℃.图1 诱导温度对重组蛋白表达的影响Figure 1 Effect of induction temperature on recombinant protein expression

2.1.2 表达菌不同生长期对重组蛋白表达的影响以时间为横坐标，以菌液OD600为纵坐标，绘制E.coliBL21(pETXm3)生长曲线，如表1和图2所示，细菌生长0～1 h为迟缓期，细菌缓慢生长；2～13 h为对数期，细菌快速生长，菌液OD600从0.090升至1.423，且1～4 h生长速率最大，5～13 h生长趋于平稳；14～16 h细菌生长进入稳定期，OD600维持在1.402～1.404，生长速率接近为零。

图2 E.coli BL21(pETXm3)生长曲线Fig 2 The growth curve of E.coli BL21(pETXm3)

表1 不同培养时间E.coli BL21(pETXm3)菌液OD600Table 1 Bacterial broth OD600 of E.coli BL21(pETXm3)at different culture times

不同生长期重组蛋白表达情况如图3所示，E.coliBL21(pETXm3)培养2 h(OD600值0.259)时，目的蛋白表达量较少，从4 h(OD600值0.715)起表达量开始积累，且存在可溶表达，6～10 h(OD600值0.895～1.295)表达量差异较小，为目的蛋白表达量高峰期，直至培养12 h(OD600值1.339)时表达量开始下降。从以上分析可知，表达菌OD600为0.895～1.295时开始诱导，目的蛋白表达量较高。

M.蛋白marker；NC1.未诱导菌细胞裂解物上清；NC2.未诱导菌细胞裂解物沉淀；1/2/3/4/5/6. 培养2 h/4h/6 h/8 h/10 h/12 h后诱导菌液细胞裂解上清；7/8/9/10/11/12. 培养2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h后诱导菌液细胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane NC2. The precipitation of cell lysates without induction；Lane 1/2/3/4/5/6. The induced supernatant of cell lysates induced after 2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h incubation；Lane 7/8/9/10/11/12. The induced precipitation of cell lysates induced after 2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h incubation.图3 不同生长期E.coli BL21(pETXm3)重组蛋白的表达Fig 3 Expression of recombinant protein of E.coli BL21 (pETXm3) in different growth periods

2.1.3 诱导时间的优化E.coliBL21(pETXm3)经IPTG在37 ℃条件下分别进行2、4、6和8 h诱导表达，从SDS-PAGE电泳图中可得知，目的蛋白在最佳温度37 ℃诱导4 h后表达量开始增多并趋稳，诱导4、6和8 h的表达量彼此差异不大，但从图中可看出，诱导6 h无论是可溶蛋白还是包涵体的表达量，相对较多，故选择诱导6 h为最佳诱导时间。

M.蛋白marker；NC1.未诱导菌细胞裂解物；1/2/3/4. 诱导2 h/4 h/6 h/8 h后细胞裂解上清；5/6/7/8. 诱导2 h/4 h/6 h/8 h后细胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane 1/2/3/4. The supernatant of cell lysates induced with IPTG for2 h/4 h/6 h/8 h；Lane 5/6/7/8. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for2 h/4 h/6 h/8 h.图4 诱导时间对重组蛋白表达的影响Fig 4 Effect of induction time on recombinant protein expression

2.1.4 IPTG浓度的优化E.coliBL21(pETXm3)分别经0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mM IPTG诱导，在37 ℃条件下振荡培养4 h后，蛋白表达情况如图5所示，0.4～2.4 mM IPTG 诱导下，目的蛋白在上清中均有一定量表达，1.6 mM时可溶性蛋白表达量最高，比例可达40%，故选择1.6 mM 作为最佳IPTG诱导浓度。

M.蛋白marker；NC.未诱导菌细胞裂解物；1/2/3/4/5/6. IPTG浓度0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM 诱导后细胞裂解上清；7/8/9/10/11/12. IPTG浓度0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM 诱导后细胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC. The cell lysates without induction；Lane1/2/3/4/5/6.The supernatant of cell lysates induced with0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM IPTG；Lane7/8/9/10/11/12. The precipitation of cell lysates induced with0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM IPTG.图5 IPTG浓度对蛋白表达的影响Fig 5 Effect of IPTG concentration on protein expression

3 讨论与结论

随着现代生物技术发展，许多外源蛋白通过基因技术工程在不同表达系统中得到了高效、正确的表达，并在生物制品、食品、医药等领域广泛应用。外源基因表达系统又有原核和真核之分，其中原核表达应用较多的表达系统有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；真核表达系统则主要为酵母、昆虫杆状病毒以及哺乳动物细胞[6]。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、易于操作、培养周期短、成本低廉、使用安全等诸多优点，故本研究使用全球广泛使用的大肠杆菌PET系列表达载体，T7启动子支配下，一经加入IPTG诱导剂，外源蛋白即可开始高效表达。影响蛋白表达的因素有很多，同类研究大多选择诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间这些项目进行优化[7-9]，除此之外，还有培养基pH值[10]、溶氧量、补料碳源等[11]，但后3种因素更适用于实际生产中大规模发酵，本研究不再进行详细比较。故本研究选取了常见的诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间这三项优化条件，除此之外，还对诱导菌液浓度对可溶蛋白表达量的影响进行了分析，因为细菌不同生长时期，菌密度、酶活性、代谢速度均有不同，这将对外源蛋白表达具有直接影响。

前期研究中构建的ε毒素的重组突变体为可溶性表达[12]，所以本研究重点关注如何提高上清中目的蛋白表达量。在比较诱导菌液浓度对可溶蛋白表达量的影响时，经过测得菌液OD600值为0.090～ 1.423时处于生长对数期，1.423以后进入稳定期，而本研究获得最佳诱导状态OD600值0.895～1.295正是处于生长对数期的中后阶段，培养基营养相对较多，酶活性较强，菌密度适中，所以最适于外源蛋白表达。此外将37 ℃作为最佳诱导温度，在实践生产中具有十分重要的意义，因为诱导温度越高，导致蛋白合成速度越快，有些时候过多的蛋白来不及正确折叠而导致包涵体产生，而包涵体在后期复性时需要费时费力且不一定和原蛋白天然构象一致，为了达到可溶表达效果，诱导温度甚至是低温。本研究将37 ℃作为最佳诱导温度，省去了实际生产中低温冷却的工序，能极大降低生产成本，具有较好应用前景。综上所述，37 ℃、菌液OD600值为0.895～1.295时，以1.6 mM IPTG诱导6 h条件下可溶性表达量最高，这将为产气荚膜梭菌突变体的进一步研究提供依据。