薏苡仁油自纳米乳化体系的建立及体外释放

易 醒，李 娟，易孜成，罗俊溢，袁弋婷，夏小华，肖小年*

薏苡仁是禾本科的草本植物，为药食同源的原料，其营养价值较高，在健脾祛湿、抗癌、降低血压和免疫调节等方面具有多种作用[1-2]。薏苡仁油（Coix seed oil，CSO）是薏苡仁中的主要生物活性组分，有显著的抗肿瘤作用，主要含有甘油三酯、甘油二酯等成分[3]。目前以CSO 为原料生产的康莱特注射液已广泛运用在肝癌、胃癌等的治疗及辅助治疗[4]。然而，CSO 较差的水溶性、稳定性和口服生物利用度，限制了其在食品及医药领域的使用和发展[5]。目前，对于CSO 制剂，以微乳制剂[6]、纳米粒、脂质体[7]、薏苡仁油酯微胶囊形式居多，鲜有CSO 自乳化体系及其体外释放的相关报道。

自乳化递送系统是由亲脂性或疏水性物质、油相、表面活性剂（Surfactant，SA）和助表面活性剂（Cosurfactant，CoSA）组成，在胃肠道蠕动的内环境条件下，可自发乳化成粒径小于500 nm 的水包油（O/W）型乳剂[8]。根据液滴尺寸大小，自乳化递送系统可分为自纳米乳化递送系统（Self-nanoemulsifying Delivery System，SNEDS） 和自微米乳化递送系统 （Self-microemulsifying Delivery System，SMEDS）[9]。目前研究发现，SNEDS 可解决水难溶性物质在胃肠道内快速分散、溶解与吸收的问题，达到显著提高口服生物利用度，增加在胃肠道的溶出及促进吸收的目的[10]，对提高BCS Ⅱ类药物生物利用度有较多帮助。

本文尝试采用伪三元相图及星点设计-效应面优化等方法构建薏苡仁油自纳米乳化体系（CSO-SNEDS），并对其特性进行表征。同时，基于体外释放试验，对CSO-SNEDS 体外释放及动力学进行研究。本研究期望解决CSO 存在的低水溶性问题，并为CSO-SNEDS 体内释放情况的研究与预测提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

薏苡仁油，广州和博香料有限公司；胰酶、胃蛋白酶、透析袋，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚-35（EL-35），BASF；聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯（Tween80）、聚氧乙烯山梨醇酐棕榈酸酯（Tween40）、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯（Tween20）、蓖麻油聚氧乙烯醚-40（EL-40）、聚乙二醇400（PEG-400）、失水山梨醇单油酸酯 （Span80）、聚氧乙烯山梨醇酐硬脂酸酯（Tween60）、失水山梨醇单月桂酸酯（Span20）、丙二醇、丙三醇，均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AED110 电子天平，美国奥豪斯Adventurer 公司；DK-S24 电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；RH-数显磁力搅拌器，德国IKA 公司；TDL-5-A 低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；T6 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；NICOMP380ZL 激光纳米粒度测定仪，英国马尔文粒度分析仪公司；SHA-A 数显恒温水浴振荡器，常州天瑞仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 CSO-SNEDS 的制备过程 准确称取所需量的SA、CoSA 和CSO，置于小烧杯中，在60 ℃下搅拌（250 r/min）约20 min，使其均匀混合，直至形成黄色的澄清黏稠液体。取0.1 mL 的上述制备的混合物至10 mL 蒸馏水中，在37 ℃条件下低速搅拌（100 r/min），考察其自乳化情况。以外观是否澄清透明和自乳化时间为指标，确定该配方能否形成自乳化制剂。

据文献所述，自乳化速率等级可如下所示（表1），其中A、B 级符合试验要求[11]。

表1 自乳化速率等级表Table 1 Self-emulsification rate grade table

1.3.2 CSO 与SA、CoSA 互溶情况考察 将1 mL CSO 分别加入到装有4 mL 不同SA （分别为Tween80、EL-40、EL-35、Tween60、Tween40、Tween20）或不同CoSA（分别为丙三醇、丙二醇、聚乙二醇400）的具塞离心管中，涡旋混匀后，3 500 r/min 离心1 min，若可互溶则继续加入CSO，以出现分层和浑浊为临界指标评估互溶情况。

1.3.3 配方的初步筛选试验

1.3.3.1 单一SA 的筛选 分别以Tween60、EL-35、EL-40 作为SA，按质量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 准确称取SA 与CSO，在不使用CoSA 的情况下，按1.3.1 节进行CSOSNEDS 制备，并考察其自乳化情况。

1.3.3.2 CoSA 的筛选 分别以PEG 400 和丙三醇作为CoSA，固定SA 与CoSA 质量比（Km）为2∶1，按质量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 准确称取SA 与CSO，按1.3.1 节进行CSOSNEDS 制备，并考察其自乳化情况。

1.3.3.3 复合SA 的筛选 选取Tween60、EL-35、EL-40 分别和Span80、Span20 进行复配，复配比例为9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，CoSA 为丙三醇，固定Km=3∶1，复合SA 与CSO 质量比为9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，按1.3.1 节进行CSO-SNEDS 制备，并考察其自乳化情况。

1.3.3.4 伪三元相图的绘制 采用初步筛选结果来进行伪三元相图绘制，根据微乳区大小来确定Km范围和最高载油量，具体方法如下：将油相、SA和CoSA 作为伪三元相图的3 个顶点，将SA 与CoSA 按照质量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例混合，再将制得的混合物与油相以质量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例混匀，将可形成自微乳点连线成面即得相图。

1.3.4 星点设计-效应面优化法优化配方

1.3.4.1 试验设计 结合伪三元相图的试验结果，选取对自纳米乳化体系影响较显著的油相质量分数（X1，oil%）和Km（X2）作为考察因素，以自乳化时间和透光率作为评价指标。

透光率的测定是由吸光度值换算得出，自乳化时间的测定方法：取0.1 mL CSO-SNEDS 至10 mL 蒸馏水中，在37 ℃条件下低速搅拌 （100 r/min），于0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，5 min 时取样进行吸光度测定，当吸光度值趋于稳定不再改变时，此时自乳化制剂已经乳化完全，即为自乳化时间。

依据星点设计原理拟采用二因素，五水平设计因素水平表，将油相比例控制在10%～22%，Km范围控制在1～5，试验设计如表2所示。

表2 星点设计的因素及水平Table 2 Factors and levels of star point design

1.3.4.2 模型拟合 将试验所得数据采用Design Expert 8.0.6 软件进行处理，以评价指标分别对各因素进行回归分析和数学模型拟合，并绘制效应面三维图。

1.3.4.3 验证试验 采用效应面优化配方，以自乳化时间、透光率作为评价指标，通过比较试验值与效应面预测值之间的差异性进行验证。

1.3.5 CSO-SNEDS 的理化特性表征

1.3.5.1 外观及稀释后的外观 室温下观察最优配方制得的CSO-SNEDS 的外观。然后在温和搅拌下，取1 mL 加入到100 mL 蒸馏水（37 ℃）中，进行分散性试验以考察其自乳化情况。

1.3.5.2 液滴尺寸和ζ-电位 将优化的CSOSNEDS 在恒定磁力低速搅拌下用蒸馏水（1∶100）稀释。使用马尔文粒度仪通过激光散射测定液滴尺寸、多分散性指数（Polydispersity index，PDI）和ζ-电位。测定3 次取平均值。

1.3.5.3 自乳化速率 取0.1 mL 最优配方制得的CSO-SNEDS 加入到装有10 mL 蒸馏水的样品瓶中，在相同条件时，测定在不同温度、转速、稀释倍数下的自乳化时间和体系透光率。

1.3.6 CSO-SNEDS 的体外释放研究

1.3.6.1 反向透析法 人工胃液 （Simulated gastric fluid，SGF）、人工肠液 （Simulated intestinal fluid，SIF）根据2015 版《中国药典》进行配制[12]。

分别移取180 mL 的SIF 于两个锥形瓶中，每个锥形瓶中放入7 个装有2 mL SIF 的透析袋，分别取2.40 g CSO 和同等CSO 含量的SNEDS 于锥形瓶中，并将其置于摇床（37 ℃恒温）中，分别于0.5，1，1.5，2，4，6，8 h 从锥形瓶中取一个透析袋，取样备用。

CSO-SNEDS 在SGF 中释放考察，参照上法操作。

1.3.6.2 释放液的测定 依据先前研究显示[13]，甘油三酯是CSO 中的主要成分。本文采用试剂盒法测定透析袋释放介质中甘油三酯含量，取样品2.5 μL 置于酶标板中，加250 μL 工作液，37 ℃孵育10 min 后，用全波长酶标仪测定吸光度，并进行数据分析。

根据公式计算甘油三酯累计释放量：

式中：Mt——甘油三脂累计释放量，mg；Q——甘油三酯累计释放率，%；Ci——第i 次取样时甘油三酯的释放质量浓度，mg/mL；V——第1次取样前的体积，mL；Ci-1——i 时间取样点的前一个取样点时甘油三酯的质量浓度，mg/mL；V样——每次取样对应的体积，mL。

1.3.6.3 体外释放动力学模型的拟合 参照文献[13]，选用5 种释放方程对甘油三酯累计释放率进行曲线拟合，根据拟合优度判断体外释放动力学类型。

1.4 数据分析

试验数据采用Origin 2017 软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 CSO 与不同SA、CoSA 的互溶情况

根据试验结果，CSO 与SA 的互溶情况：Tween60>EL-35>EL-40>Tween40>Tween80>Tween20，CSO 与CoSA 的互溶情况：PEG400>丙三醇>丙二醇。

CSO 与Tween60、EL-35、EL-40、PEG400 和丙三醇均能很好的相溶，未出现分层或浑浊，因此，选用Tween60、EL-35、EL-40 作为SA，PEG400 和丙三醇作为CoSA 进行试验。

2.2 配方筛选试验结果

选取CSO 溶解度较好的3 种SA 和两种CoSA 进行配方筛选试验，试验结果显示PEG400/EL-35/CSO，丙三醇/EL-35/CSO 体系，Tween60/丙三醇/CSO 体系均可形成CSO-SNEDS，但载油量较低，以Tween60/丙三醇/CSO 体系最佳，载油量可达16%左右。

根据已有研究显示，复合SA 相比于单一SA可形成更稳定的复合凝聚膜，因此更易形成稳定的自纳米乳化体系[14]。因此本试验采用复合SA（Tween60/Span80 或 Tween60/Span20）/丙三醇/CSO 体系进一步进行配方筛选。结果表明，仅Tween60/Span20/丙三醇/CSO 体系可形成CSOSNEDS，其中Tween60/Span20 质量比=9：1。另外，如图1所示，复合SA（Tween60/Span20）/丙三醇=8∶2～5∶5 时，自纳米乳化体系均可形成，且当复合SA（Tween60/Span20）/丙三醇=8∶2 时，体系油相比例最高为18.60%，此时自乳化等级仅为B，因此该体系还需进一步优化。

图1 复合SA（Tween60/Span20）/丙三醇/CSO 体系伪三元相图Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram of complex surfactant （Tween60/Span20）/glycerol/CSO system

2.3 星点设计-效应面优化法优选配方

2.3.1 模型拟合 采用表2进行星点设计试验，其响应值如表3所示。采用Design Expert 8.0.6软件，对各因素分别进行多元线性、二项式拟合，结果显示二次多项式为最佳方程（表4）。

表3 星点设计表与结果Table 3 Star design table and results

表4 各响应值的回归方程Table 4 Regression equation of each response value

回归方差分析显著性检验表明，Y1和Y2的回归方程的P<0.0001，说明模型回归显著，失拟项不显著（P>0.05），说明该模型具有统计学意义，即自乳化时间和透光率的非线性拟合效果较好，相关系数较高，结果具有统计学意义，可用来进行CSO-SNEDS 的配方优化。

2.3.2 效应面分析 由图2可知，当Km值一定时，随着油相质量分数的增加，自乳化时间延长，油相质量分数在一定范围内时，透光率逐渐上升，当油相质量分数较大时，透光率逐渐下降，不再呈现透明或半透明状态。当油相的质量分数一定时，自乳化时间随Km的增加而增加，透光率呈现先增加后减小的趋势。

图2 油相质量分数、Km 值对自乳化时间及透光率影响的效应面图及等高线图Fig.2 Effect surface diagram and contour diagram of oil phase mass fraction and Km value on self-emulsification time and light transmittance

2.3.3 效应面估测及最佳验证试验 通过软件的预测分析功能、拟合方程及其三维效应面图综合分析，在试验范围内以载油量（油相质量分数）、自乳化时间和透光率为综合考察指标，结合配方的初步筛选试验，得到最佳配方：油相质量分数为16.11%，Km=3.54，其中油相为薏苡仁油，复合SA为Tween60/Span20＝9∶1，CoSA 为丙三醇。根据最优配方制备CSO-SNEDS，考察预测值与实测值的偏差，结果表明，自乳化时间及透光率与预测值之间没有显著差异，表明预测性良好。试验结果见表5。

表5 验证配方评价指标的预测值与试验值（n=3）Table 5 Predictive value and experimental value of verified prescription evaluation index （n=3）

2.4 CSO-SNEDS 的理化特性

2.4.1 CSO-SNEDS 外观及液滴尺寸 如图3b所示，CSO-SNEDS 为淡黄色澄清透明体系，将其稀释后可形成微泛蓝光、澄清透明的乳液。另外，SNEDS 粒径大小决定着CSO 溶出速率与溶出度，是影响其在体吸收和生物利用度的重要因素。如图3a 所示，CSO-SNEDS 的平均粒径为47.52 nm（＜100 nm），且呈正态分布，符合对纳米乳的理想要求[15]。

图3 CSO-SNEDS 的粒径分布（A）及外观（B）Fig.3 Particle size distribution （A） and appearance （B）of CSO-SNEDS

2.4.2 自乳化速率 由表6可知，转速和温度对自乳化时间的影响很大，对透光率影响较小，而稀释倍数对自乳化时间的影响较小，对透光率影响较大。随着转速的增大，CSO-SNEDS 的自乳化时间减小，透光率增加。自乳化时间随着温度的升高明显缩短，可能是由于温度较高时，增加了各分子间的碰撞，从而降低油水界面间的界面能，有利于形成乳剂。

表6 自乳化速率体外评价Table 6 In vitro evaluation of self-emulsification efficiency

2.5 CSO-SNEDS 体外释放及动力学

体外释放度是评价纳米制剂质量的重要指标[16]，采用反向透析法对CSO 及其SNEDS 的体外释放性进行评估。由图4可知，SNEDS 显著提高了CSO 在SIF 与SGF 中的累计释放量，8 h 后分别为2.98 倍与9.54 倍。CSO 不易溶于人工消化液，多漂浮于表面，不利于甘油三酯的扩散，而CSOSNEDS 为粒径较小的O/W 体系，其可于消化液中均匀分散并更大程度被释放[17]，这可能是SNEDS提高CSO 体外释放量的最主要原因。另外，CSO与CSO-SNEDS 在SIF 中的释放量均高于SGF，这可能是由于弱酸性的CSO 更易溶解于碱性SIF 而引起的[18]。

图4 CSO-SNEDS 在体外释放模型中的释放情况Fig.4 Release of CSO-SNEDS in vitro model

将CSO-SNEDS 在两种人工消化液中的累计释放率分别用5 种方程进行释放动力学拟合[13]，拟合结果如表7所示。Ritger-Peppas 方程的拟合优度更高，其在人工肠液与胃液中的释放拟合系数分别为0.731 和0.912，可较好地描述CSO-SNEDS在消化液中的释放规律。另外，对于Ritger-Peppas方程来说，n（释放指数）是用来表征释放机制的特征参数，如果0.450.89 时，为骨架溶蚀机制[20-21]。试验结果表明，CSO-SNEDS 在人工胃液及肠液中的释放指数n 均小于0.45，属于Fick 扩散机制。

表7 CSO-SNEDS 在SGF 与SIF 中的体外释放动力学拟合结果Table 7 Results of in vitro release kinetics of CSO-SNEDS in SGF and SIF

3 结论

本文以CSO 作为油相，通过配方筛选试验及伪三元相图的绘制结果，成功构建了以Tween60/Span20/丙三醇/CSO 为体系的CSO-SNEDS。同时，使用星点设计-效应面法，以透光率、自乳化时间为评价指标，通过模型效应面图及模型拟合确定了各组分比例，即油相质量分数为16.11%，Km值为3.54，其中复合SA 为Tween60/Span20=9∶1，CoSA 为丙三醇。优化所得CSO-SNEDS 载油量较高，外观为黄色澄清液体，稀释后稳定性较好。体外释放结果表明，SNEDS 中CSO 的体外释放量显著提升，其体外释放动力学均符合Ritger-Peppas方程，且符合Fick 扩散机制。