let-7d-5p介导姜黄素的抗氧化作用

李媛媛，陈玮鑫，曾 珺，刘静雯，李 健，李桂玲*

（1集美大学食品与生物工程学院 福建厦门361021 2福建省海洋功能食品工程技术研究中心 福建厦门361021 3厦门市海洋功能食品重点实验室 福建厦门361021）

姜黄素是从姜黄植物根茎中提取的一种植物多酚[1]，具有抗炎、抗肿瘤和抗氧化等多种功用[2]，常被用作食品添加剂或者膳食补充剂[3]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是含氧的高效氧化物，主要产生于线粒体内膜的电子传递链中[4]。ROS 过度增加会破坏体内氧化与抗氧化系统的平衡，进而导致细胞氧化损伤[5-6]。研究表明姜黄素可以通过抑制活性氧产生来阻止细胞损伤及凋亡[7]。抗氧化系统的失衡也是导致心血管疾病和神经退行性疾病等慢性疾病发生的重要原因之一[8]，同时ROS 的过量表达也会损伤肝脏功能，诱导多种肝脏疾病的发生[9]。姜黄素也可通过抑制慢性酒精引起的ROS 产生并增强肝脏的抗氧化能力[10]，对肝脏疾病起到一定的预防作用。然而，姜黄素的分子作用机制尚不明确。表观遗传调控包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和微小RNA（microRNA，miRNA）表达的调控[11]。有研究表明，姜黄素可能通过抑制DNA 甲基转移酶，调节miRNA 表达来发挥活性作用[12]。

miRNA 是一类由内源基因编码的长度为20～25 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，通过种子序列 （5’ 端第2～8 位核苷酸） 识别靶信使RNA（mRNA）3’UTR 上的结合位点，携带RISC（RNAinduced silencing complex，RNA 介导的沉默复合体）发挥作用[13]。miRNA 可以通过调节线粒体代谢来影响细胞活性氧水平[14]，也可以调节细胞抗氧化调控的相关因子。如miR-34a 及miR-93 是氧化防御过程中关键基因的转录后抑制因子[15]。let-7 家族是表达丰度高的线粒体miRNA[16]，通过对相关基因的调节发挥抗氧化活性。如let-7b、let-7c 可以间接调控细胞保护酶即血红素加氧酶（HMOX1）来减轻人肝细胞的氧化损伤[17]。近年来的研究发现miRNA 是姜黄素的新靶标，姜黄素可以调节脑、肾及肝脏等相关疾病中几种致病性miRNA 的表达，也可通过调节miR-181、miR-21和miR-19 等的表达在癌症治疗中发挥作用[18]。心血管和慢性肾脏等疾病的发生与氧化应激密切相关[19]，探究姜黄素是否通过对miRNA 的调节来发挥抗氧化作用，对阐述其活性作用的分子机制具有重要意义。

本研究通过寻找受姜黄素调节的miRNA，探究miRNA 对姜黄素抗氧化作用的影响，为姜黄素等功能食品的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝脏细胞系LO2 购自中国科学院上海细胞库。

DMEM 高糖培养基、青霉素-链霉素混合溶液，美国Hyclone 公司；胎牛血清，美国Gemini 公司；姜黄素，美国Sigma 公司；总抗氧化能力检测试剂盒、ROS 检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；超氧化物歧化酶测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；M-MLV 逆转录酶试剂盒，美国Promega 公司；SYBR Premix Ex Taq II荧光定量试剂盒，大连宝生物工程有限公司；qPCR 引物、miRNA 阴性对照 （miR-NC）、let-7d-5p 类似物（let-7d-5p mimic），广州锐博生物科技有限公司；TRIzol、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000，美国Thermo Fisher 公司；其余有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

VCX130PB 超声波细胞破碎仪，美国Sonics公司；SYNERGY/H1 酶标仪，美国Biotek 公司；ABI7300 实时荧光定量PCR 仪，美国Applied Biosystems 公司；Guava easyCyte 流式细胞仪，美国Millipore 公司；Forma 3111 细胞培养箱，美国Thermo 公司；5810R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及增殖率测定 LO2 细胞生长在添加1%双抗溶液（青霉素-链霉素）和10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，于37 ℃、充有5%CO2的恒湿细胞培养箱中培养。

取对数生长期的细胞并制备成单细胞悬液，以1×104/孔的细胞密度接种于96 孔板中，贴壁后用姜黄素处理24 h，然后加入0.5 mg/mL 的四甲基噻唑蓝（MTT）溶液孵育4 h，再加入DMSO 并振荡10 min，在490 nm 下测定吸光度。以DMSO 为溶剂对照，计算公式如下：

式中：A0——空白对照上清液的吸光度；A1——溶剂对照上清液的吸光度；A2——姜黄素处理样品上清液的吸光度。

1.3.2 ROS 水平检测 利用荧光探针 （DCFHDA）检测ROS 水平。DCFH-DA 本身无荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH 生成有绿色荧光的DCF。检测DCF 的荧光强度即可知道细胞内活性氧的水平。细胞收集后用10 μmol/L 的DCFH-DA 探针标记30 min，然后用Opti-MEM 无血清培养基清洗去除残余染料并重悬，采用流式细胞仪检测绿色荧光强度（Ex/Em=488/525 nm）。

1.3.3 总抗氧化能力检测 细胞收集后用预冷的磷酸盐缓冲液清洗、超声波破碎提取总蛋白，用BCA 法测定蛋白含量，并采用碧云天总抗氧化能力检测试剂盒 （ABTS 法S0119、FRAP 法S0116）检测细胞总抗氧化能力。

1.3.4 抗氧化酶活性检测 样品处理同1.3.3 节，采用南京建成生物工程研究所的总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（A001-3）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（A005-1）和碧云天过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（S0051）分别检测细胞的抗氧化酶活性。

1.3.5 miRNA 的表达检测 用实时荧光定量PCR 测定miRNA 表达水平。即用TRIzol 法提取细胞总RNA 和用M-MLV 逆转录酶系统进行逆转录，最后用SYBR Green 法进行荧光定量PCR。以U6 为内参，结果分析采用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量，其中：ΔΔCt=ΔCt（试验）-ΔCt（对照），ΔC=Ct（目的miRNA）-Ct（U6）。

1.3.6 miRNA 瞬时转染 参照lipofectamine2000（Liopo2000）转染试剂说明书进行转染，用不含抗生素的培养基培养细胞，待细胞密度达到70%左右时转染。即用Opti-MEM 无血清培养基分别稀释转染试剂Lipo2000 及miRNA 并静置5 min，然后将其混合、静置20 min 后再转入到细胞培养基中，6 h 后更换新鲜培养液，继续培养48 h 待用，并用实时荧光定量PCR 法检测miRNA 的转染效率。

1.3.7 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件对数据进行分析，用单因素方差分析比较组间差异，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，数据以±s 表示。

2 结果

2.1 姜黄素对细胞增殖的影响

LO2 细胞用姜黄素处理24 h 后用MTT 法检测其增殖率。不同浓度姜黄素对LO2 细胞增殖的影响如图1所示。与对照相比，5 μmol/L 和10 μmol/L 姜黄素对细胞生长有一定促进作用。随着姜黄素浓度的继续升高细胞增殖率开始下降，有细胞开始死亡，因此将20 μmol/L 设为姜黄素处理LO2 细胞的上限浓度。

图1 姜黄素处理24 h 后LO2 细胞增殖率的变化Fig.1 Effect of 24 h curcumin treatment on the proliferation rate of LO2 cells

2.2 姜黄素降低ROS 水平

ROS 是细胞正常生理代谢下的产物，伴随细胞的呼吸作用而产生。为了探究姜黄素对细胞抗氧化能力的影响，在确定姜黄素作用浓度后，采用DCFH-DA 探针法检测姜黄素对ROS 水平的影响。细胞ROS 水平检测结果如图2所示，5～20 μmol/L 姜黄素处理细胞24 h 后，ROS 水平降低（P＜0.05）。提示姜黄素可能通过降低生产或提高清除能力减少ROS 的积聚。

图2 姜黄素对LO2 细胞活性氧水平的影响Fig.2 Effect of curcumin on ROS level of LO2 cells

2.3 姜黄素提高总抗氧化能力

细胞内存在多种有抗氧化能力的物质，它们通过清除过量的ROS 来抵御ROS 所引起的氧化应激反应。总抗氧化能力即细胞内抗氧化物质的总水平，有不同的检测模型及检测手段，本研究采用ABTS 法及FRAP 法检测。ABTS 法原理为ABTS 被氧化物氧化成绿色的ABTS 自由基（ABTS·+），而抗氧化物可以抑制绿色物质的产生；FRAP 法原理为在酸性条件下抗氧化物可以还原铁离子产生蓝色的亚铁离子。根据目标待测物对ABTS 自由基清除和铁离子（Fe3+）还原的能力可推测其抗氧化活性。姜黄素总抗氧化能力的检测结果如图3所示。姜黄素清除ABTS 自由基的能力显著高于对照 （P＜0.05）（a），且能提高细胞内的Fe3+还原能力（b）。这说明姜黄素处理可提高细胞抗氧化物质的水平，即提高细胞的总抗氧化能力。

图3 姜黄素对LO2 细胞总抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of curcumin on total antioxidant capacity of LO2 cells

2.4 姜黄素提高抗氧化酶活性

ROS 的消除包括内源和外源系统。抗氧化酶系是细胞内源性抗氧化防御系统的主要组成部分。抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等。SOD 通过歧化分解高氧化强度的超氧阴离子来抵御细胞的氧化损伤，CAT 通过催化过氧化氢产生水和氧气降低过氧化氢含量，GSH-Px 可以催化过氧化氢和羟基自由基的分解来提高抗氧化能力。LO2 细胞抗氧化酶活性的检测结果如图4所示。与对照相比，5 μmol/L 姜黄素可提高部分抗氧化酶的活性，而10 μmol/L 姜黄素处理后细胞的SOD、CAT 和GSH-Px 酶活性均显著升高。但20 μmol/L 姜黄素处理导致CAT 酶活性有所下降，可能是因为该浓度下细胞死亡较多引起了复杂的反应。这个结果提示抗氧化酶活性的升高可能是细胞总抗氧化能力提高的原因之一。

图4 姜黄素对LO2 细胞抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of curcumin on antioxidant enzyme activities of LO2 cells

以上结果表明，姜黄素可能通过提高SOD、CAT 和GSH-Px 酶的活性降低LO2 细胞内的ROS 水平，提高细胞的总抗氧化能力。但具体的作用机制还有待研究。姜黄素对表观遗传具有调节作用，被认为是DNA 甲基转移酶的抑制剂，同时也可以通过调控miRNA 表达来发挥活性作用[20]。因此本文进一步研究姜黄素对miRNA 表达的调节作用。

2.5 姜黄素上调let-7d-5p 的表达量

在前期研究中发现姜黄素可调节不少miRNA 的表达水平，其中包含let-7 家族的多个miRNA（结果未显示）。let-7d-5p 是let-7 家族的一员，姜黄素对其表达的影响如图5所示。与对照相比，姜黄素处理后细胞内let-7d-5p 表达量显著增加，即姜黄素促进let-7d-5p 表达。miRNA 参与调控细胞生命活动诸多过程，如细胞分化、细胞代谢等。因此，本文进一步研究了let-7d-5p 与姜黄素抗氧化活性的关系，即其是否可以调节细胞的抗氧化能力。

图5 姜黄素对LO2 细胞内let-7d-5p 表达量的影响Fig.5 Effect of curcumin on let-7d-5p expression level in LO2 cells

2.6 let-7d-5p 调节细胞的抗氧化能力

姜黄素上调let-7d-5p 的表达，因此本研究通过转染let-7d-5p 类似物（let-7d-5p mimic）提高其在LO2 细胞内的水平，并检测细胞的抗氧化能力。如图6a 所示，转染类似物后，细胞内let-7d-5p 的表达量显著提高，说明转染成功。对LO2 细胞ROS 水平检测的结果表明，转染let-7d-5p 类似物后，细胞ROS 水平显著降低（P＜0.05）（图6b、6c），提示let-7d-5p 提高细胞的抗氧化能力。对细胞抗氧化能力的其它测定结果显示，转染let-7d-5p 类似物后ABTS 自由基清除能力及铁离子还原能力显著提高（P＜0.05）（图6d、6e）。let-7d-5p 还显著提高SOD、CAT 和GSH-Px 的酶活力（图6f）。这些数据表明，let-7d-5p 提高了细胞的抗氧化能力，提示miRNA 可参与细胞抗氧化能力的调控。

图6 转染let-7d-5p 类似物对LO2 细胞抗氧化能力的影响Fig.6 Effect of let-7d-5p upregulation on the antioxidant capacity of LO2 cells

3 结论与讨论

本研究结果显示，姜黄素显著下调ROS 水平，提高细胞总抗氧化能力；进一步研究发现，它也显著提高SOD、CAT 和GSH-Px 的酶活力。但在20 μmol/L 姜黄素作用下CAT 酶活性有所回落，这可能是由于细胞死亡较多引起的复杂反应[21]。抗氧化酶活性的提高提示姜黄素可能通过激活内源性细胞抗氧化防御系统来降低ROS 水平，这与一些研究者的检测结果相一致。Dai 等[22]发现姜黄素通过增加SOD 活性，避免喹烯酮诱导LO2 细胞产生的氧化应激并阻止ROS 的形成。

越来越多的研究证据表明，miRNA 与细胞抗氧化关系密切。如miR-132 可以调节H9C2 细胞抗氧化及抗凋亡能力[23]。miR-1 可调节与氧化应激相关蛋白质的表达，在心脏功能障碍相关疾病中发挥作用[24]。有证据表明姜黄素可调节miRNA的表达及功能。如通过调节PxBC-3 人胰腺癌细胞系中miR-22 和miR-199 的表达发挥治疗作用[25]，或提高A549 细胞中miR-192-5p 和miR-215 的表达促进肺癌细胞凋亡[26]。但是对miRNA与姜黄素抗氧化关系的研究极少。

let-7 是与肿瘤发展相关的一个miRNA 家族。其中let-7g 被发现可减少ox-LDL 诱导的NADPH 氧化酶的增加和细胞内活性氧的生成调节细胞抗氧化能力[27]。let-7d-5p 是let-7 家族中的一员，主要调节癌症相关的基因表达[28]，对其与抗氧化能力调控的相关研究较少。本研究发现姜黄素显著提高let-7d-5p 的表达量。为了阐明let-7d-5p 是否参与细胞的抗氧化能力调节，本研究通过转染其类似物上调LO2 细胞中let-7d-5p 的水平，并检测细胞的抗氧化能力。结果显示，let-7d-5p 使LO2 细胞ROS 水平显著下降，细胞总抗氧化能力及抗氧化酶活性显著提高。这些结果表明，姜黄素通过上调let-7d-5p 的表达参与细胞抗氧化能力的调控。let-7d-5p 在细胞抗氧化系统中可能发挥着重要的调节作用，但作用机理还有待研究。如let-7d-5p 通过什么方式提高细胞抗氧化能力，如何介导姜黄素的活性调控，姜黄素如何调节let-7d-5p 表达等。这些问题的答案将是姜黄素抗氧化作用机理的重要补充。姜黄素抗氧化活性的分子机制尚不明确，其作为抗氧化食品添加剂的理论依据还不够充分。探究姜黄素抗氧化的分子机制对其功能活性及相关功能性食品的开发具有现实意义。