尿素14C胶囊中55Fe分析方法研究

马莉娜，宋丽娟，杨永刚，王亚东，马 彦，戴雄新

(中国辐射防护研究院，山西 太原 030006)

幽门螺旋杆菌(Hp)是目前所知能在人体胃酸中生存的唯一微生物种类。Hp感染能引发多种胃病，在2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中Hp被列为一类致癌物。目前，14C尿素呼吸试验是Hp感染检测的有效方式。尿素14C胶囊的初始14C原料通过中子辐照高纯氮化铝(AlN)靶获得[1-2]，为保证药品的放射性纯度，需分析AlN靶原料经辐照后可能产生的放射性杂质核素及其放射性活度。《美国药典》[3]《中国药典》2015 年[4]均未给出详细可行的尿素14C胶囊中放射性杂质核素的检验方法。因此，需建立实际可行的尿素14C胶囊中放射性杂质核素的检验方法，确保药品质量。

高纯AlN靶中Fe、Co元素的最高含量分别可达到1 500 ppm及600 ppm[5]。Fe、Co等杂质元素被中子活化生成55Fe、60Co等放射性核素，其母体54Fe和59Co热中子吸收截面较大，55Fe(t1/2=2.74 a)和60Co(t1/2=52 711 a)半衰期长，因此，55Fe和60Co是最有可能引起14C标记尿素原料药的放射性核纯度超标的主要杂质核素。60Co为高能β-γ核素，较易通过γ能谱、液闪或Cerenkov计数测量来检验[6-7]，而55Fe是电子俘获衰变核素，其发射的低能俄歇电子及X射线的探测效率低，易被屏蔽而难以检测。对55Fe最灵敏的检测手段是液闪计数，但其液闪能谱处于极低能区[8-11]，14C为纯β放射性核素，最大能量为156 keV[12]，能谱处于较高能区，完全覆盖活度很低的55Fe 能谱，因此检测14C标记尿素样品中低活度的55Fe需首先将高活度14C从样品中完全分离，才能进行55Fe的液闪测量。本工作拟建立尿素14C胶囊中放射性杂质核素55Fe分析方法，并对方法进行验证，以满足尿素14C胶囊生产中的质控需求。

1 实验

1.1 主要试剂和仪器

55Fe标准溶液比活度为59 kBq/g，美国国家标准技术研究所(NIST)；14C标准淬灭源、Hisafe闪烁液，美国Perkin Elmer；浓HCl、六水合三氯化铁，市售分析纯。

Hidex-300SL液体闪烁计数器(LSC)，芬兰Hidex；X射线荧光光谱分析仪、Milli-Q Reference超纯水机系统，美国默克；XS-205分析天平，分度值为0.1 mg，美国梅特勒。

1.2 胶囊样品中55Fe的化学分离及测量流程

胶囊样品中55Fe的化学分离及测量流程示于图1。具体过程如下。

1) 将AGMP-1强碱性阴离子交换树脂在高纯水中浸泡1 h，将浸泡好的树脂装入2 mL树脂柱中，加入5 mL 9 mol/L HCl平衡树脂。

图1 尿素14C胶囊中55Fe的放化分析流程Fig.1 Flow diagram of radioanalytical procedure for determination of 55Fe in urea 14C capsule

2) 取1粒胶囊样品和2 mL高纯水加入50 mL离心管中，60 ℃水浴加热至胶囊溶解后加入5 mg稳定铁示踪剂和10 mL 12 mol/L HCl，混合均匀。

3) 将第2步所得胶囊溶解液通过树脂柱，再用10 mL 9 mol/L HCl以1 mL/min的流速淋洗树脂柱，之后用3 mL 0.1 mol/L HCl将铁洗脱至50 mL离心管中。在离心管中加入10 mL 12 mol/L HCl，混合均匀，再次通过树脂柱，样品全部流出后，用10 mL 9 mol/L HCl以1 mL/min的流速淋洗树脂柱，最后用3 mL 0.1 mol/L HCl将铁洗脱至20 mL聚乙烯(PE)闪烁瓶中。在闪烁瓶中加入0.6 mL 15 mol/L H3PO4、1 mL水和14 mL Hisafe闪烁液，避光放置12 h，采用LSC测量并计算55Fe的活度。

1.3 铁标准工作曲线

称取0.970 5 g分析纯级六水合三氯化铁于20 mL PE液闪瓶中，再加入0.1 mol/L HCl配置成10 mg/g的稳定铁溶液。准确称取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g浓度为10 mg/g的Fe3+溶液于系列20 mL PE闪烁瓶中，用0.1 mol/L HCl定量至3.000 0 g，混合均匀后，用X射线荧光光谱仪(XRF)测量其浓度，绘制铁的标准曲线。

图2 XRF测量的Fe3+标准曲线Fig.2 Standard curve of Fe3+ by XRF

1.4 14C活度测量

1) 尿素14C胶囊中14C活度测量

取1粒胶囊样品，转移至50 mL离心管中，加入2 mL高纯水，60 ℃水浴加热至胶囊溶解，取出0.2 g，转移至20 mL聚乙烯闪烁瓶中，加入1 mL高纯水和14 mL Hisafe闪烁液，混合均匀，采用LSC测量并计算胶囊中的14C活度。

2) 纯化后样品中14C活度测量

在纯化后的洗脱液中加入14 mL Hisafe闪烁液，混合均匀，避光放置12 h后，采用LSC测量并计算样品中14C的活度。

1.5 14C及55Fe液闪测量效率校正

1)14C液闪测量效率校准

取系列14C标准淬灭源，用LSC测量计数，测量时间为5 min。由式(1)计算每个淬灭源的14C测量效率ε14C。

(1)

其中：Am为14C淬灭源的活度测量值，Bq；Ae为14C淬灭源的活度理论值，Bq；Di为14C样品两管符合计数；D0为空白两管符合计数；t为测量时间，s；

样品的三管、两管符合计数比(TDCR)计算公式如下：

(2)

其中：Ti为样品三管符合计数；T0为空白三管符合计数。

14C的测量效率与TDCR的关系曲线如图3所示，分析窗口为5～650道。

图3 14C的TDCR-LSC效率校正曲线Fig.3 TDCR-LSC efficiency correction curve of 14C

2)55Fe液闪测量效率校准曲线

LSC测量55Fe时选择的分析窗口为20～250道，淬灭校正曲线表达式如式(3)[8]所示。

ε55Fe=1.53TDCR0.91

(3)

1.6 流程验证

在尿素14C胶囊样品中，加入已知活度的标准55Fe，按照1.2节所述流程分离后，测量胶囊样品中55Fe的活度，验证流程的准确性。

2 方法的建立与验证

2.1 方法建立

55Fe的分离纯化可采用阴离子交换树脂、TRU树脂、溶剂萃取等手段[8,13]。阴离子交换树脂对铁有良好的选择性以及较高的吸附容量，铁离子与9 mol/L HCl生成阴离子络合物吸附在阴离子树脂柱上[8-9]，而碳不会吸附在阴离子树脂柱上，可用适当的淋洗剂将其从树脂柱上洗脱，从而达到分离纯化的目的。测量尿素14C胶囊样品中的55Fe时需将14C完全去除，胶囊中14C活度在μCi级，远高于55Fe的活度，此外，55Fe淋洗液中含有高活度14C，不能直接排放，需在淋洗过程中考虑将淋洗液最小化，以方便放射性废物的后续处理。已报道的文献中，55Fe纯化时，每个样品淋洗液的体积超过60 mL[8-9]，会生成大量放射性废液，因此需对方法进行改进。

将样品按1.2节溶解并调节酸度后，通过2 mL AGMP-1树脂柱，再用10 mL 9 mol/L HCl淋洗14C、0.1 mol/LHCl洗脱55Fe后测量，样品中14C残余量可达到30 Bq，会显著干扰55Fe的测量。将洗脱后的样品用12 mol/L HCl调至9 mol/L，再次通过2 mL AGMP-1树脂柱，用10 mL 9 mol/L HCl淋洗，淋洗液的测量结果示于图4。由图4可知，14C低于检测限(0.1 Bq)，其测量谱与空白样品无差异。以上结果表明，采用AGMP-1树脂柱2次纯化可有效除去样品中的高活度干扰核素14C，并将淋洗液的体积减小至20 mL，有利于放射性废物的储存与处理。

图4 AGMP-1树脂柱2次纯化后的胶囊样品与空白样品的14C液闪测量谱Fig.4 Liquid scintillation spectra of 14C in capsule sample after purified twice by AGMP-1 resin column and blank sample

2.2 尿素14C胶囊中放射性杂质55Fe核纯度限值估算

根据药品制剂中<1 mg 的单个杂质按1%或5 μg(取最小值)的质控限度要求[14]，可限定其中任意一种放射性杂质核素所造成的辐射剂量(即待积有效剂量，CED)不高于尿素胶囊中14C 本身所致剂量的1%，即：

(4)

式中：CEDI为放射性杂质核素的待积有效剂量；CED14C为14C的待积有效剂量；DCFI为放射性杂质核素的剂量系数；DCF14C为14C的剂量系数；AI为胶囊样品中放射性杂质核素的活度；A14C为胶囊样品中14C的活度。据此，可推导出式(5)用以估算尿素14C胶囊的放射性核纯度(RP14C)：

(5)

根据式(5)可限定尿素14C胶囊中放射性杂质核素的纯度。根据AlN靶中杂质元素的含量、中子反应截面、辐照时间及冷却时间估算，尿素14C胶囊中最主要的放射性杂质核素为55Fe和60Co。尿素14C胶囊中主要杂质的放射性核纯度计算结果列于表1。由表1可看出，放射性核纯度限值要求最高的杂质核素是60Co，假设所有的杂质都是食入剂量系数最大的60Co时，计算得到尿素14C胶囊制剂的放射性核纯度要求为99.83%。本工作取99.9%作为尿素14C胶囊制剂的放射性核纯度要求，相应地单个放射性杂质核素55Fe的限值要求为0.1%。

表1 尿素14C胶囊中14C及主要杂质核素的放射性核纯度估算结果Table 1 Estimation result of radionuclide purity of main impurity nuclide in urea 14C capsule

2.3 55Fe分析方法验证

尿素14C胶囊样品中55Fe活度的测定属于杂质核素的限量检查。根据药典2015年版[4]中“药品质量标准分析方法验证指导原则”，杂质限度测定方法的验证指标包括专属性、检测限和耐用性。

1) 专属性

尿素胶囊中14C活度约为3.7×104Bq，远高于胶囊样品中可能存在的55Fe的放射性活度，是测量55Fe最主要的干扰核素，14C的去污效果是影响方法专属性最主要的因素。本实验测量4批次胶囊样品中14C的初始活度，并根据式(6)计算流程对14C的去污因子(DF)。

(6)

式中：Q14C,0为初始样品中14C的活度，Bq；Q14C为纯化后样品中14C的活度，Bq；QFe,0为初始样品中加入的稳定铁的质量，mg；QFe为纯化后样品中稳定铁的质量，mg；RFe为铁的回收率(RFe=QFe/QFe,0)。

14C及55Fe的检测限(MDA)由式(7)[16]计算：

(7)

式中：k为包含因子，取值1.645(置信度为95%)；B为液闪测量时空白样品的二管符合计数；f为用于液闪测量的样品质量与放化分离得到的样品质量的比值；ε为液闪计数器的测量效率。

4批次胶囊样品中14C的初始活度、纯化后活度及流程对14C的去污因子列于表2。由表2可见，纯化后14C活度均低于MDA，去污因子均>3×105，可见本方法可高效分离样品中的高活度干扰核素14C。因此，可认为本方法对尿素14C胶囊中55Fe的测量具有很强的专属性。

表2 不同批次尿素14C胶囊样品纯化后14C去污因子Table 2 14C decontamination factor of different batches of urea 14C capsule after purification

2) 耐用性

样品溶解、过柱、淋洗步骤中由于人为操作所造成的损失，均可由回收率进行校正，以确保方法的耐用性。流程开始时在尿素14C胶囊样品中加入稳定铁作为示踪剂，流程结束后，用XRF测量接入PE闪烁瓶中样品的稳定铁含量，每个样品测量3 min，计算样品浓度及回收率，结果列于表2。由表2可见，铁的回收率在57%～67%之间，回收率较低的样品可能是由于样品在多次上样、转移的过程中沾在容器壁上造成的损失。

3) 检测限

根据2.2节，胶囊样品中55Fe的放射性核纯度限值低于0.1%，14C的活度约为3.7×104Bq，故胶囊中若能准确测得37 Bq的55Fe，即可说明本工作建立的分离测量流程完全适用于胶囊样品中55Fe的测量。

在4个批次的尿素14C胶囊样品中分别加入约30 Bq和3 Bq的55Fe放射性标准溶液，按1.2节所示流程分离后，测量样品中55Fe的活度，结果列于表3，可见测量值与标称值的相对偏差小于±10%。

表3 加标样品的测量结果Table 3 Measurement result of spiked sample

胶囊样品加标前后的液闪测量谱示于图5。从图5可看出，采用55Fe分析流程分离纯化后的加标样品，55Fe 的信号明显可见，依据该谱图即可判断胶囊样品中是否含有高于核纯度限值的55Fe。

图5 加入标准55Fe样品与空白样品的液闪测量谱Fig.5 Liquid scintillation spectra of spiked standard 55Fe sample and blank sample

3 实际胶囊样品中55Fe的测量

按本文所建立流程测定上海某医药公司生产的4批次尿素14C胶囊的平行样品，结果列于表4。从表4可知，4批次样品均未检测到高于55Fe 检测限(0.4 Bq)的信号，满足55Fe放射性核纯度小于0.1%的质控要求。这主要是由于辐照后AlN靶需经过一系列化学转化合成流程最终制备成14C标记的尿素，这些化学转化及合成工艺对14C中的放射性核素杂质有极高效的分离效果。

表4 尿素14C胶囊样品中55Fe的测量结果Table 4 Measurement resultof 55Fe in urea 14C capsule

4 结论

1) 本工作计算了尿素14C胶囊样品杂质核素55Fe的限值，建立了尿素14C胶囊样品中55Fe活度测定方法：胶囊样品溶解后，采用AGMP-1阴离子交换树脂对其进行2次分离纯化，再用液体闪烁计数器测量55Fe的活度。

2) 验证了方法的专属性、耐用性和检测限。

3) 实际尿素14C胶囊实测结果表明，本文所建方法满足55Fe放射性核纯度小于0.1%的质控要求。