胆碱脂肪酸/氨基酸对PEG模拟干旱胁迫下玉米萌发的影响

耿梦瑶 程文聪 陈丽红 李亚君 陈晓红

(1西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100；2西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100)

胆碱氨基酸/胆碱脂肪酸离子液体是一类以胆碱作为阳离子，氨基酸/脂肪酸作为阴离子合成的新型离子液体，这类离子液体除了具有较高的热稳定性和化学稳定性、较强溶解能力、不易挥发以及可设计性等优点外，还具有低毒性和生物可降解性[1]。目前，胆碱类离子液体主要应用于木质纤维素生物质的预处理领域，在秸秆预处理方面具有良好的应用前景[2－3]。Liu等[4]通过简单、绿色的途径合成一系列胆碱氨基酸离子液体，发现大多数胆碱氨基酸离子液体能有效溶解木质素；此外，用胆碱类离子液体处理小麦、水稻秸秆时能有效提高酶解效率，且离子液体可重复利用，但随着回收次数的增多，其回收率降低，对木质素的萃取效果变差，从而不得不将之废弃。因此，要实现秸秆预处理过程中离子液体绿色高效循环利用，残液的合理处理和利用十分重要。

迟晓丽[5]将秸秆预处理后的残液用于盆栽番茄，结果发现胆碱脯氨酸处理残液对番茄的生长发育具有促进作用，能有效提高番茄植株的抗病能力，这为残液的重复利用提供了绿色有效的新途径，同时拓展了胆碱类离子液体在农业生产方面的利用。胆碱类离子液体中的阳离子胆碱是一种广泛存在于动植物体内，用于合成细胞膜等结构的季胺类物质，具有维持细胞膜结构完整性，促进质膜流动及提高生物膜选择透性等生理功能[6]，同时胆碱也是渗透调节物质——甘氨酸甜菜碱合成的初始底物。研究发现，干旱胁迫下玉米幼苗中的胆碱含量大幅度增加，并诱导甘氨酸甜菜碱的大量积累，调节干旱引起的渗透胁迫[7]。另外，胆碱类离子液体中的阴离子氨基酸和短链脂肪酸在作物生长和抗逆方面也发挥着重要作用。氨基酸可以缓解非生物胁迫造成的损伤，同时也可作为植物激素的前体物质调节作物的生长[8－9]。外源天冬氨酸、谷氨酸能显著降低渗透胁迫下荞麦叶片质膜透性和MDA 含量，显著提高抗氧化酶活性[10]。同时，Wu 等[11]研究了胆碱氨基酸离子液体对水稻种子萌发和根长的影响，结果表明，胆碱天冬氨酸能促进水稻种子萌发和根长的生长，有望用作水稻的生长促进剂。此外，胆碱类离子液体作为一种新型的离子液体，与传统的离子液体相比表现为更低的毒性，传统的离子液体如咪唑类离子液体在作物生长方面已有较多的研究，其能通过改变植物细胞结构，降低光合作用、抗氧化酶活性，改变激素代谢水平，如促进衰老相关激素(乙烯和脱落酸)的生物合成，以及生长促进激素(赤霉素)的失活等来影响作物幼苗的生长发育，且离子液体的毒性随烷烃链的增加而增加[12－17]。而目前关于胆碱类离子液体对作物生长影响的研究较少，且关注点尚且停留在离子液体对作物正常生长的影响方面。

本试验在前期研究的基础上分别挑选2 种胆碱脂肪酸和4 种胆碱氨基酸离子液体，研究聚乙二醇－6000(polyethylene glycol－6000，PEG)模拟干旱胁迫下胆碱类离子液体浸种处理对玉米种子萌发与根芽生长的影响，旨在为探究胆碱类离子液体影响作物生长以及对作物抗旱性方面的生理机制提供理论基础，拓展胆碱类离子液体在农业领域的利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米种子品种为郑单958，购自北京德农种业。氢氧化胆碱(46%)购自美国Sigma 公司；氨基酸和脂肪酸购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 离子液体的合成

在前人合成离子液体的方法上稍加改进[2，18]。在常温下，按照2 ∶1 摩尔比，将氢氧化胆碱水溶液(46%)逐滴加入己二酸、辛二酸水溶液中；氢氧化胆碱与苏氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺按1 ∶1摩尔比的剂量滴加。整个过程在磁力搅拌器上进行，每次滴加少量，确保充分混匀。滴加完成后，在摇床反应48 h(18℃，200 r·min－1)，反应完成后溶液pH 值在7.0～9.0 之间，在55℃条件下旋转蒸发除去水分，然后将所得液体于55℃真空干燥48 h，即得胆碱脂肪酸/氨基酸离子液体，室温下为浅黄色至黄色液体。以氘代水为溶剂，采用AVANCEⅢ400 MHz 核磁共振光谱仪(德国Bruker 公司)测定离子液体的氢谱，并进行谱图分析，表征所合成离子液体的结构，确认所合成离子液体的正确性。

1.3 试验设计

经过前期筛选，选用4 种胆碱氨基酸(胆碱缬氨酸、胆碱苏氨酸、胆碱天冬氨酸、胆碱天冬酰胺)和2种胆碱脂肪酸(胆碱己二酸、胆碱辛二酸)进行浸种处理。选取大小均匀，健康饱满的玉米种子，用75%乙醇消毒5 min，然后用蒸馏水冲洗干净。分别用200 mg·L－1胆碱氨基酸、胆碱脂肪酸和蒸馏水浸种12 h，以蒸馏水浸种作为对照。之后，将浸种后的种子在发芽盒中萌发，并使用PEG－6000 模拟干旱胁迫，具体方法如下:在发芽盒(长×宽×高:19 cm×13 cm×12 cm)底部铺有双层滤纸，PEG 模拟干旱胁迫处理使用30 mL 13% PEG 溶液(13% PEG 浓度根据前期预试验确定，属于中等程度胁迫)浸湿滤纸，将不同胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种后的种子整齐放置于滤纸上萌发。同时，将蒸馏水浸种处理的对照种子分为2 组，一组为蒸馏水对照(CK－蒸馏水)，另一组为PEG 对照(CKPEG)(干旱胁迫处理方法同上)。每个发芽盒中放置25 粒种子，每处理3 次重复，进行2 次重复试验。种子萌发于28℃恒温培养箱(黑暗)内进行。每隔24 h记录一次发芽数，连续记录5 d，计算玉米种子的发芽率、发芽势以及发芽指数。5 d 后，每盒取6 颗幼苗测定根长、芽长；并剥取完整的种胚进行后续幼胚可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、过氧化氢(H2O2)含量等生理指标的测定。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 萌发参数 根据公式计算发芽率、发芽势和发芽指数:

发芽率＝供试种子发芽数/供试种子总数×100%

发芽势＝3 d 内供试种子的发芽数/供试种子总数×100%

发芽指数＝ΣGt/Dt

式中，Gt 为第t 天的发芽数，Dt 为相应的发芽天数。

1.4.2 玉米种胚生理指标 本研究所测定的酶活性用比活力表示，即每毫克可溶性蛋白所含的酶活力单位。可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G250 染色法[19]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定采用氮蓝四唑(nitroblue terazolium，NBT)光还原法[19]；过氧化物酶(peroxidase，POD)活性测定采用愈创木酚法[20]；过氧化氢酶(catalase，CAT)活性、MDA 含量测定参照高俊凤[21]的方法；H2O2含量测定采用硫酸钛法[21]。

1.5 数据分析

数据统计分析采用单因素方差分析LSD 法进行。数据统计分析使用R 软件(版本:3.6.1)“agricolae”程序包完成。

2 结果与分析

2.1 胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种子萌发的影响

由图1和表1可知，PEG 模拟干旱胁迫显著降低了玉米种子的发芽势、发芽率和发芽指数，而部分胆碱类离子液体浸种有利于缓解干旱胁迫对玉米种子萌发的抑制作用。胆碱己二酸、胆碱辛二酸浸种处理后，干旱胁迫下玉米种子的发芽指数相比CK-PEG 处理分别提高了42.6%、40.2%，差异显著，而种子的发芽势、发芽率提高不显著。4 种胆碱氨基酸浸种处理后，玉米种子的3 个萌发参数均高于CK-PEG 处理，其中，胆碱天冬氨酸、胆碱天冬酰胺浸种处理后种子的发芽势均显著提高至75.0%。

表1 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸离子液体对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种子萌发参数的影响Table 1 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acid ILs on seed germination parameters of maize under PEG simulated drought stress

图1 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种子萌发的影响Fig.1 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on seed germination of maize under PEG simulated drought stress

2.2 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米萌发后根芽生长的影响

由表2可知，PEG 模拟干旱胁迫严重抑制了玉米种子萌发后根芽的生长，胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种处理能缓解PEG 模拟干旱胁迫对玉米根芽生长的抑制作用。相比CK-PEG 而言，PEG 模拟干旱胁迫下胆碱己二酸、胆碱辛二酸离子液体浸种处理的玉米芽长分别增加24.9%、22.9%，根长分别增加4.2%、11.7%；胆碱天冬氨酸、胆碱天冬酰胺浸种处理后玉米根芽生长均显著增加，芽长分别增加46.1%、40.3%，根长分别增加26.7%、13.8%。

表2 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸离子液体对PEG 模拟干旱胁迫下玉米萌发后根芽生长的影响Table 2 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs on the growth of maize root and shoot under PEG simulated drought stress

2.3 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚抗氧化酶活性的影响

由图2可知，与CK－蒸馏水相比，PEG 模拟干旱胁迫显著降低了玉米种胚中抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性。PEG 模拟干旱胁迫下，胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸离子液体浸种处理有利于提高玉米种胚的抗氧化酶系活性。与CK-PEG 相比，胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种有利于提高SOD 活性，其中胆碱天冬酰胺处理的SOD 活性显著提高了41.2%。胆碱类离子液体浸种总体显著提高PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚POD 和CAT 活性；在2 种胆碱脂肪酸离子液体中，胆碱辛二酸浸种处理的POD 活性较CK-PEG 提高了108.5%；4 种胆碱氨基酸离子液体浸种处理中胆碱缬氨酸、胆碱苏氨酸处理的POD 活性较CK-PEG 分别提高了108.7%、120.3%；活性胆碱缬氨酸、胆碱天冬氨酸浸种处理的CAT 活性较CK－PEG 分别提高了121.9%、117.2%。

图2 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚抗氧化酶活力的影响Fig.2 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on antioxidant enzyme activities of maize embryo

2.4 胆碱脂肪酸和氨基酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚MDA、H2O2 含量的影响

由图3可知，PEG 模拟干旱胁迫导致玉米种胚中MDA 和H2O2含量显著增加。与CK-PEG 相比，胆碱类离子液体浸种处理后玉米种胚中MDA、H2O2含量均显著下降。其中，胆碱己二酸、胆碱辛二酸浸种处理后，玉米种胚中MDA 含量分别降低了42.8%、47.3%；胆碱缬氨酸、胆碱天冬酰胺浸种处理后，种胚中MDA含量分别降低了45.6%、51.3%；胆碱缬氨酸、胆碱天冬酰胺浸种处理后，种胚中H2O2含量分别降低了42.5%、29.8%。

图3 胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸浸种对PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚MDA 和H2O2 含量的影响Fig.3 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on MDA and H2O2content of maize embryo

3 讨论

发芽率、发芽势和发芽指数是衡量植物种子萌发表现的重要指标，干旱胁迫下种子的发芽势、发芽率等显著降低，使种子萌发受到明显的抑制，而外源生长调节剂或激素浸种能有效缓解干旱胁迫对种子萌发的抑制作用[22－23]。同时，前人关于离子液体对作物生长的研究也提出，低浓度的离子液体可促进作物的生长，其作用类似于植物生长调节剂[24－25]。在本研究中，胆碱己二酸、胆碱辛二酸、胆碱天冬氨酸和胆碱天冬酰胺浸种处理能显著提高PEG 模拟干旱胁迫下玉米种子的部分萌发参数，缓解PEG 模拟干旱胁迫对玉米种子萌发的抑制作用，并有效促进PEG 模拟干旱胁迫下玉米种子萌发后玉米根芽的生长，这与外源生长调节剂的作用存在相似性；另外，在本研究PEG 模拟干旱胁迫下，胆碱类离子液体浸种处理后种子的发芽率增加不显著的原因可能是试验所用种子活力较高，所以导致浸种处理后种子发芽率与CK-PEG 处理相比差异不显著。

植物在遭受生物或非生物胁迫后，可造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量积累，导致氧化胁迫的产生。植物体内的抗氧化酶系统(如SOD、POD、CAT 等)在清除活性氧方面发挥着重要作用，且这些酶的作用是高度专一的[26－27]。SOD 将转化为O2和H2O2[28]，而POD、CAT 将H2O2分解为O2和H2O，这些酶的相互关联依次将植物体内的ROS 转化为无毒物质。本研究中，PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚中抗氧化酶活性显著降低，模拟干旱胁迫下，与CKPEG 相比，胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种处理的玉米种胚中抗氧化酶活性的总体趋势为部分处理下SOD活性显著提高，所有胆碱类离子液体浸种处理POD 活性均显著增加，且除胆碱苏氨酸外，所有胆碱类离子液体浸种处理CAT 活力均显著增加，可见，本研究考察的胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种有利于提高模拟干旱胁迫下抗氧化酶活性。本研究还发现，与CK-PEG 相比，所有胆碱类离子液体浸种处理均显著降低了干旱胁迫下种胚中的H2O2含量，这与不同胆碱类离子液体浸种下较高的POD、CAT 活力是相符的。MDA 含量在一定程度上反映细胞内脂质过氧化水平和细胞损伤程度。与CK-PEG 相比，胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种处理能显著降低PEG 模拟干旱胁迫下玉米种胚的MDA 含量，缓解了PEG 模拟干旱胁迫对玉米种子的氧化损伤。

4 结论

本研究结果表明，利用胆碱脂肪酸和胆碱氨基酸浸种有利于缓解PEG 模拟干旱胁迫对玉米种子萌发的抑制作用，这可能与不同胆碱浸种处理下玉米种胚抗氧化酶活性提高，MDA、H2O2含量降低有关。使用本研究中考察的不同胆碱氨基酸和胆碱脂肪酸浸种有助于提高PEG 模拟干旱胁迫下玉米种子的萌发指标及萌发后种子根、芽的生长状况。