miR-191靶向BDNF基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖

唐湘薇，楚丹，颜赛娜，尹艳飞，卞桥，翁波，陈斌，冉茂良

研究报告

miR-191靶向基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖

唐湘薇，楚丹，颜赛娜，尹艳飞，卞桥，翁波，陈斌，冉茂良

湖南农业大学动物科学技术学院，畜禽遗传改良湖南省重点实验室，长沙 410128

睾丸支持细胞数量是影响精子生成能力的主要因素之一，microRNA (miRNA)参与调控猪未成熟支持细胞的发育过程，然而，大多数被鉴定出的miRNA对支持细胞的作用及其机制尚不明确。基于本课题组前期高内涵筛选结果，本文进一步通过流式细胞术、蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因等方法，研究了调控猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用机理。结果表明：过表达显著促进细胞周期由G1期进入S期和G2期，细胞增殖能力显著增强，细胞凋亡率显著降低；而抑制表达则与之相反。双荧光素酶报告基因系统验证直接靶向基因3′-UTR。抑制表达基因促进细胞周期进入S期，并促进细胞增殖而抑制细胞凋亡，与过表达的作用一致。共转染试验结果显示，基因可以拮抗对细胞增殖和凋亡的调控作用。此外，过表达和抑制表达基因均可显著促进PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PI3K和AKT的磷酸化水平，且基因同样拮抗对PI3K和AKT蛋白的调控作用。本研究结果证实靶向基因，通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖且抑制其凋亡，为进一步解析调控猪精子生成的生物学功能提供了理论基础。

；基因；PI3K/AKT信号通路；增殖；猪睾丸支持细胞

睾丸支持细胞作为生精小管内一种体细胞，不仅通过细胞间的紧密连接形成血睾屏障，为精子细胞的生长发育提供物理支撑和稳定的微环境，还分泌多种细胞因子以保障和促进精子细胞的成熟。猪睾丸支持细胞增殖活性的高峰期在出生至1月龄与初情期前后两个阶段，随后睾丸支持细胞增殖活性逐渐丧失，公猪性成熟后睾丸组织中支持细胞数量保持相对恒定[1]。然而，每个成熟的支持细胞仅能支撑30～50个精子细胞的生长发育，因此支持细胞数量与成年雄性动物睾丸组织大小、精子密度、精子活力、生精小管中生殖细胞数量和间质细胞数量息息相关[2,3]。这表明猪睾丸支持细胞的增殖活性决定着性成熟后睾丸支持细胞数量，进而影响公猪整个使用年限内的精子发育和成熟以及精液品质。

MicroRNA (miRNA)作为一类长约22 nt的非编码RNA，通过靶向蛋白编码基因3′-非翻译区(3′-un-translated region, 3′-UTR)抑制其翻译过程，从而广泛参与调控细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学过程。近年来，利用RNA-seq技术已从不同发育阶段的猪睾丸组织中鉴定出300余个miRNA[4～6]，且经细胞分离后，相比于生精细胞，18个miRNA高表达于支持细胞[7]。在此基础上，多个miRNA已被证实在猪睾丸支持细胞的生长发育过程中具有重要调控作用。例如：[8]、[9]和[10]等调控猪睾丸支持细胞增殖；[11]、[12]和[13]等调控猪睾丸支持细胞氧化应激水平；调控猪睾丸支持细胞自噬活性[14]。本课题组前期采用高内涵筛选技术对60个miRNA调控猪未成熟支持细胞增殖的作用进行了筛选，鉴定出包括在内的27个miRNA对猪未成熟支持细胞具有较强的促增殖效应[15]，但的作用机制尚不清楚。研究表明，可以促进多种细胞的增殖，例如肝癌细胞[16]、食管鳞状细胞[17]、成纤维细胞[18]等。基于miRNA序列在物种间的高度保守性，我们推测对猪未成熟支持细胞增殖具有重要的调控作用。因此，本研究利用流式细胞术、CCK-8 (cell counting kit-8)、EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)、实时荧光定量PCR (quantitative real time PCR, qRT-PCR)、Western blotting和双荧光素酶报告基因等技术解析了调控猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的靶基因及信号机制，为进一步阐明调控猪睾丸发育和精子生成的机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

猪睾丸细胞系(swine testicular, ST) ATCC®CRL- 1746TM和293T工具细胞购自上海安为生物科技有限公司，其中ST已被证实为猪未成熟支持细胞[19]，且广泛应用于相关研究[8,15]。细胞培养基为DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)：胎牛血清(美国Gibco公司)：双抗(Penicillin-Streptomycin，美国Gibco公司)= 10∶1∶0.11，并将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 细胞转染

设计合成模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)序列过表达和抑制表达，设计合成基因siRNA (5′-GCCAACTGAAGCAGTACTT- 3′)抑制表达基因。接种细胞于6孔板，在融合度达到60%～70%时，吸弃培养基，每孔加入1 mL PBS (美国Gibco公司)洗涤，重复操作2次，吸弃PBS。向DMEM高糖基础培养基(每孔250 μL)中加入Lipofectamine 2000试剂(每孔5 μL，美国Invitrogen公司)，充分混匀成试剂①，室温静置5 min；再向DMEM 高糖基础培养基(每孔250 μL)中分别加入mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC、siRNA、siRNA NC、inhibitor +siRNA、inhibitor + siRNA NC和inhibitor NC + siRNA NC (每孔5 μL，广州锐博生物科技有限公司)，充分混匀成试剂②，室温静置5 min；将试剂①与试剂②混匀，静置30 min后加入细胞液中。每组至少设置3个重复，转染6～8 h后更换为完全培养基继续培养，以备后续实验使用。

1.3 流式细胞周期检测

细胞转染24 h后，胰酶(美国HyClone公司)消化并收集细胞于1.5 mL EP管，每管加入250 μL PBS重悬，将细胞悬液逐滴加入750 μL预冷乙醇中，4℃过夜保存，1000 r/min离心5 min，弃上清，每管加入1 mL预冷的PBS，重悬细胞，1000 r/min离心5 min，弃PBS，每管加入150 μL浓度为100 µg/mL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(长沙维尔生物科技有限公司)，在4℃避光条件下染色30 min。使用流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)检测细胞周期分布情况。

1.4 细胞增殖检测

接种细胞于96孔板，采用CCK-8(东仁化学科技(上海)有限公司)和EdU试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)检测细胞增殖情况。CCK-8检测方法：分别转染24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续置于37℃、5%CO2条件下孵育1 h，使用酶标仪于450 nm波长下检测每孔细胞的吸光度值，将24 h作为对照，计算48 h的相对增殖率。EdU检测方法：转染24 h后，每孔加入100 μL EdU培养基，继续置于37℃、5%CO2条件下孵育2 h，并严格按照EdU试剂盒使用说明书进行细胞固定、Apollo染色和DNA染色，置于荧光显微镜(德国ZEISS公司)下拍照，并使用Image J软件对图片中的所有活细胞和有丝分裂细胞计数。

1.5 流式细胞凋亡检测

接种细胞于6孔板，采用Annexin V-FITC/PI染色法(南京凯基生物科技发展有限公司)于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。流式细胞凋亡检测：转染24 h后，胰酶消化并收集细胞，每管加100 μL 1× Binding Buffer (上海碧云天生物技术有限公司)重悬洗涤，加入5 μL Annexin V-APC试剂孵育15 min，加5 μL PI染色液重悬细胞，置于4℃避光，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 细胞ATP水平检测

接种细胞于6孔板，转染24 h后，弃去培养基，PBS清洗2次，每孔加入200 μL ATP裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，静置裂解5 min，收集细胞于1.5 mL EP管，4℃、15,000 r/min离心5 min，使用ATP试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)按照使用说明检测细胞ATP水平。

1.7 Western blotting检测

收集细胞于1.5 mL EP管，采用RIPA lysis buffer (上海碧云天生物技术有限公司)提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)在酶标仪上对总蛋白进行定量。每孔加10 μL煮沸的蛋白样品于10%SDS-PAGE的分离胶和5%SDS-PAGE的浓缩胶(上海碧云天生物技术有限公司)中，先60～80 V、30 min，然后调整为100～ 120 V、60 min进行电泳，观察溴酚蓝至胶板底部即可停止。使用电流300 mA、40 min条件进行转膜，随后加入含5%脱脂奶粉的TBST封闭液(北京索莱宝科技有限公司)，摇床室温封闭条带1.5 h，加入一抗于4℃孵育过夜。一抗包括：Bcl2 (1∶1000，美国Protein Tech Group公司)、BAX (1∶2000，美国Protein Tech Group公司)、Caspase-3 (1∶100，英国Abcam公司)、p-PI3K (1∶1000，phospho-Tyr458，美国Cell Signaling Technology公司)、p-AKT (1∶1000，phosphoSer473，美国Affinity Biosciences公司)和β-actin (1∶2000，美国Protein Tech Group公司)。最后，加入适量二抗稀释液，室温摇床2 h。二抗包括：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (1∶1000，上海碧云天生物技术有限公司)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (1∶1000，上海碧云天生物技术有限公司)。二抗洗涤后，使用ECL化学发光液(上海翊圣生物科技有限公司)与膜孵育1 min，采用保鲜膜完全包裹印迹膜，在暗盒内与X胶片曝光10 min，显影冲洗。

1.8 实时荧光定量PCR

采用TRIzol试剂盒(美国Thermo公司)提取细胞总RNA，采用核酸/蛋白浓度测定仪(NanDrop ND- 2000，美国Thermo Scientific公司)检测总RNA质量，合格的总RNA使用PrimeScriptTMRT试剂盒(日本TaKaRa公司)进行cDNA逆转录。采用Oligo 6.0软件设计实时荧光定量PCR (qRT-PCR)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息见表1。构建25 μL qRT-PCR反应体系，包括12.5 μL SYBR Premix Ex(2×，日本TaKaRa公司)、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2 μL cDNA模板和8.5 μL ddH2O。反应体系置于IQ-5荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)上采用如下程序进行qRT-PCR反应：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；55℃～95℃溶解30 s，81个循环。基因作为内参基因，每组设置3个重复。采用2–ΔΔCt公式计算各基因的相对表达水平。

表1 本研究所用的引物序列

1.9 双荧光素酶活性检测

将合成的(brain-derived neurotrophic factor)基因3′-UTR-WT和3′-UTR-MUT序列(广州市锐博生物科技有限公司)连接至psiCHECK2载体，筛选阳性克隆并测序确认后，与mimic和mimic NC在DMEM high glucose基础培养基条件下两两组合共转染至293 T细胞，48 h后收集细胞，每孔加35 μL PBS、35 μL luciferase reagent (美国Promega公司)，震荡10 min，移至96孔白色细胞培养板中，采用多功能酶标仪(Spectra max m5e，美国Molecular Devices公司)测定荧光值；每孔加30 μL Stop reagent (美国Promega公司)，震荡10 min后，测定荧光值。

1.10 统计分析

采用IBM SPSS 22.0软件进行统计分析，使用One-Way ANOVA进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较以评估各组之间的差异。数据均以平均值±标准差的形式表示，*<0.05，**<0.01。

2 结果与分析

2.1 miR-191促进猪未成熟支持细胞增殖

为明确对猪未成熟支持细胞增殖的作用，分别转染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC。流式细胞周期结果表明，过表达后，处于G1期的细胞比例极显著降低(<0.01)，S期和G2期的细胞比例显著增加(< 0.05) (图1A)，抑制表达后，处于S期和G2期的细胞比例则显著降低(<0.05) (图1C)。采用qRT-PCR技术检测细胞周期相关基因的表达，结果表明，过表达极显著促进、、和基因的表达水平(<0.01) (图1B)，而抑制表达则显著抑制以上基因的表达水平(<0.05) (图1D)。以上结果表明，促进猪未成熟支持细胞周期进程。

采用qRT-PCR技术检测细胞增殖相关基因的表达水平。结果表明，过表达显著增加、、、和基因的表达水平(< 0.05) (图1E)，而抑制表达则显著降低细胞增殖相关基因的表达(<0.05) (图1F)。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，结果表明过表达极显著提高细胞增殖能力(<0.01)，而抑制表达则极显著降低细胞增殖能力(<0.01) (图1G)。此外，EdU染色结果表明，过表达显著促进细胞增殖活性(<0.05)，而抑制表达则极显著降低细胞增殖活性(<0.01) (图1：H和I)。

2.2 miR-191抑制猪未成熟支持细胞凋亡

为进一步明确对猪未成熟支持细胞凋亡的影响，本研究采用Annexin V-FIT/PI方法检测细胞凋亡情况。结果表明，过表达显著降低细胞凋亡率(<0.05) (图2：A和B)，而抑制表达则显著增加细胞凋亡率(<0.05) (图2：A和D)。细胞ATP水平检测结果表明，过表达极显著增加细胞ATP水平(<0.01) (图2C)，而抑制表达则显著降低细胞ATP水平(<0.05) (图2E)。采用Western blotting技术检测细胞凋亡相关基因蛋白水平的表达，结果显示，过表达增加Bcl2蛋白表达水平而抑制BAX和Caspase-3蛋白表达水平(图2F)，而抑制表达则与之相反(图2G)。综上所述，抑制猪未成熟支持细胞凋亡。

2.3 miR-191靶向BDNF基因3′-UTR

本研究利用miRwalk、TargetScan和miRanda在线软件预测了不同物种中的靶基因，根据结合位点保守性分析，初步筛选出基因作为候选靶基因(图3A)。为进一步确定与基因之间的靶向关系，本研究构建了-WT和-MUT双荧光素酶报告基因载体，并与mimic和mimic NC两两组合共转染至293T细胞。双荧光素酶活性检测结果表明，-WT +mimic共转染组的双荧光素酶活性显著低于其他3组(<0.05) (图3B)。采用qRT-PCR技术检测对基因mRNA表达的影响，结果表明，过表达极显著降低基因mRNA表达水平(<0.01)，而抑制表达极显著增加基因mRNA表达水平(<0.01)。综上所述，靶向基因3′-UTR并抑制其表达水平。

图1 miR-191促进猪未成熟支持细胞增殖

A：转染mimic和mimic NC，流式细胞仪检测流式周期；B：转染mimic和mimic NC，qRT-PCR检测周期相关基因(、、和) mRNA相对表达水平；C：转染inhibitor和inhibitor NC，流式细胞仪检测流式周期；D：转染inhibitor和inhibitor NC，qRT-PCR检测周期相关基因(、、和) mRNA相对表达水平；E：转染mimic和mimic NC，qRT-PCR检测增殖相关基因(、、、和) mRNA相对表达水平；F：转染inhibitor和inhibitor NC，qRT-PCR检测增殖相关基因(、、、和) mRNA相对表达水平；G：转染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC，CCK-8试剂检测细胞增殖指数；H：转染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC，EdU试剂盒检测增殖细胞比例；I：细胞EdU实验染色图(蓝色细胞为Hoechst染色，红色细胞为EdU染色，Merge为Hoechst和EdU染色合并图，标尺：50 μm)。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

图2 miR-191抑制猪未成熟支持细胞凋亡

A：转染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；B：转染mimic和mimic NC，细胞凋亡比例统计结果；C：转染inhibitor和inhibitor NC，细胞凋亡比例统计结果；D：转染mimic和mimic NC，细胞ATP水平；E：转染inhibitor和inhibitor NC，细胞ATP水平；F：转染mimic和mimic NC，Western blotting 检测细胞凋亡标志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表达水平；G：转染inhibitor和inhibitor NC，Western blotting 检测细胞凋亡标志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表达水平。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

2.4 BDNF基因抑制猪未成熟支持细胞增殖而促进其凋亡

为解析基因对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响，针对基因序列设计了siRNA和siRNA NC，并转染至细胞。结果表明，相较于对照组，转染siRNA后，处于G1期和G2期的细胞比例显著下降(<0.05)，S期细胞比例极显著上升(<0.01) (图4A)，、和基因的表达水平显著增加(<0.05) (图4B)。此外，抑制基因的表达后，细胞增殖相关基因、、、和基因表达水平显著增加(<0.05) (图4C)；CCK-8和EdU检测结果表明，抑制基因极显著促进猪未成熟支持细胞增殖(<0.01) (图4：D，E和F)。细胞凋亡检测结果显示，抑制基因的表达可极显著抑制细胞的凋亡率(<0.01) (图5A)，促进Bcl2蛋白的表达而抑制BAX和Caspase-3蛋白的表达(图5B)，增加细胞ATP水平(图5C)。以上结果表明，抑制表达基因促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制其凋亡，与过表达的结果一致。

图3 miR-191靶向BDNF基因3′-UTR

A：与基因3′-UTR的潜在结合位点；B：共转染-WT + mimic NC、-WT +mimic、-MUT + mimic NC和-MUT +mimic后，检测双荧光素酶活性；C：转染mimic NC、mimic、inhibitor NC和inhibitor，qRT-PCR检测基因mRNA相对表达水平。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

2.5 BDNF基因拮抗miR-191的调控作用

为进一步明确是否通过靶向进而调控猪未成熟支持细胞增殖和凋亡，本研究将inhibitor +siRNA、inhibitor + siRNA NC和inhibitor NC + siRNA NC三组共转染于猪未成熟支持细胞。EdU和CCK-8结果表明，相较于inhibitor NC + siRNA NC对照组，inhibitor + siRNA NC组的细胞增殖活性显著降低(<0.05)，而inhibitor +siRNA组的细胞增殖活性则极显著升高(<0.01) (图6：A和B)。同时，相较于inhibitor NC + siRNA NC对照组，inhibitor + siRNA NC组的细胞增殖相关基因、、、和的表达水平显著降低(<0.05)，而inhibitor +siRNA组的、和基因表达水平显著增加(<0.05) (图6C)。此外，相比于inhibitor NC + siRNA NC对照组，inhibitor + siRNA NC组的Bcl2蛋白表达水平降低且BAX和Caspase-3蛋白表达水平增加，而inhibitor +siRNA组的Bcl2蛋白表达水平升高且BAX和Caspase-3蛋白表达水平降低(图6D)。以上结果表明，抑制表达基因可以拮抗对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用。

2.6 miR-191靶向BDNF基因3′-UTR激活PI3K/AKT信号通路

生物信息学分析结果表明，和基因可能作用于PI3K/AKT信号通路，因此，采用Western blotting技术检测了二者对PI3K/AKT信号通路中p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平。结果表明，过表达极显著增加p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平(<0.01) (图7A)，而抑制表达极显著抑制p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平(<0.01)(图7B)；抑制表达基因极显著增加p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平(<0.01) (图7C)，与过表达一致；同时，相比于inhibitor NC + siRNA NC对照组，inhibitor + siRNA NC组的p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平极显著降低(<0.01)，而inhibitor +siRNA组的p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平则显著增加(<0.05) (图7D)。以上结果表明，靶向基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞的增殖而抑制其凋亡。

图4 抑制表达BDNF基因促进猪未成熟支持细胞增殖

A：流式细胞术检测流式周期分布情况；B：qRT-PCR检测周期相关基因、、和的mRNA相对表达水平；C： qRT-PCR检测增殖相关基因、、、和的mRNA相对表达水平；D：CCK-8试剂检测细胞增殖指数；E：细胞EdU实验染色图(蓝色细胞为Hoechst染色，红色细胞为EdU染色，Merge为Hoechst和EdU染色合并图，标尺：50 μm)；F：EdU细胞染色统计结果。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

3 讨论

支持细胞数量是影响精子生成能力的主要因素，而提高公猪的精子产量，对实际生产中提高猪的生产效率至关重要。但是，目前关于支持细胞增殖的分子机制尚不清楚[20]。研究表明，miRNA在发育过程中调控许多基因的表达，且一些特异性的miRNA参与了未成熟支持细胞增殖的调控过程，例如[15]、[10]、[8]和[13]等。然而，分析表明，现有的关于miRNA调控猪未成熟支持细胞增殖的研究，还不足以解析其潜在的分子调控机制[21]。本课题组前期采用高内涵筛选技术鉴定出包括在内的27个miRNA具有促进猪未成熟支持细胞增殖的潜在作用，但其作用的特定分子信号途径有待进一步研究。目前，关于的研究主要集中于医学领域，例如，促进肝癌细胞[16]、食管鳞状细胞[17]和成纤维细胞[18]等的增殖，抑制胆管癌细胞[22]、乳腺癌细胞(MCF7和ZR-75)[23]和子宫内膜样癌细胞[24]等的凋亡。本研究综合采用流式细胞术、CCK-8、EdU和Western blotting等方法在细胞水平明确了促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制其凋亡，表明广泛参与调控细胞增殖和凋亡，并有可能是调控猪未成熟支持细胞的一个特异性分子。

图5 抑制表达BDNF基因促进猪未成熟支持细胞凋亡

A：流式细胞仪检测不同凋亡期细胞分布及细胞数统计；B：Western blotting 检测细胞凋亡标志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表达水平；C：细胞内ATP水平检测。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

miRNA通常靶向结合蛋白编码基因3′-UTR以抑制其翻译过程。本研究采用miRwalk、TargetScan和miRanda软件预测的靶基因，并取结果的交集，再根据结合位点的保守性筛选出基因为其潜在靶基因。随后，通过双荧光素酶报告基因实验进一步证实直接靶向基因3′-UTR的预测结合位点。但是，目前尚没有猪基因商业化蛋白抗体，导致无法在现有条件下进一步验证是否抑制了基因的蛋白翻译过程。但是，在成肌细胞和海马神经元细胞中已证实可以靶向基因并抑制其翻译过程[25～27]。基于与基因结合位点在物种间的高度保守性，因此我们推测在猪未成熟支持细胞中同样可以抑制基因的翻译过程。同时，本研究明确了抑制表达基因可促进猪未成熟支持细胞增殖并抑制细胞凋亡的，其调控作用与过表达一致。在此基础上，本文进一步设计了关于与基因的共转染试验，结果表明基因可以拮抗对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的调控作用。综上所述，本文基本确定靶向基因3′-UTR并调控了其表达。

图6 BDNF基因拮抗miR-191对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的调控作用

A：细胞EdU实验染色图(蓝色细胞为Hoechst染色，红色细胞为EdU染色，Merge为Hoechst和EdU染色合并图，标尺：50 μm)；B：CCK-8试剂检测细胞增殖指数；C：qRT-PCR检测增殖相关基因、、、和的mRNA相对表达水平；D：Western blotting 检测细胞凋亡标志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表达水平。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

细胞周期是一个受多个因子调控的复杂过程，主要参与生物的生长和发育，C作为细胞进程中一个重要的调节因子，活化后可以缩短G1期的时间，是从G1期转化至S期必不可少的调节因子之一[28]，还可以通过活化细胞周期蛋白、和而促进周期进程，若抑制的表达时，细胞周期的G1期向S期的转化将受到抑制，进而抑制细胞周期进程[29]。本研究发现，过表达和抑制表达基因后，支持细胞由G1期进入S期的比例均显著增加，且、、和的表达水平显著增加。此外，本研究还发现，过表达和抑制表达基因可显著增加、、、和的表达水平。研究表明，支持细胞本身表达以上细胞增殖相关基因，且和基因可通过激活MAPK信号通路促进细胞增殖[30]，基因则可以通过调控细胞周期相关基因的表达促进细胞周期的进程以及促进DNA复制进而促进细胞增殖[31]，基因则可以通过激活基因家族促进细胞增殖[32]。此外，本研究采用CCK-8和EdU实验进一步证实和基因可以调控猪睾丸支持细胞增殖。

图7 miR-191靶向BDNF基因激活PI3K/AKT信号

A：转染mimic和mimic NC，Western blotting检测p-PI3K和p-AKT蛋白相对表达水平及结果分析；B：转染inhibitor和inhibitor NC，Western blotting 检测p-PI3K和p-AKT蛋白相对表达水平及结果分析；C：转染siRNA和siRNA NC，Western blotting检测p-PI3K和p-AKT蛋白相对表达水平及结果分析；D：共转染inhibitor NC + siRNA NC、inhibitor + siRNA NC和inhibitor +siRNA，Western blotting 检测p-PI3K和p-AKT蛋白相对表达水平及结果分析。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

细胞凋亡是由内源性或外源性通路引起的细胞程序性死亡的过程，多个基因参与到细胞凋亡调控过程中，但基因在整个过程起决定性作用，细胞凋亡基因调控的方式分为促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡两种[33]。是促细胞凋亡基因，是抑细胞凋亡基因，二者都是通过激活下游基因以调节细胞凋亡。对各种因素引起的凋亡都有抑制作用，但能与线粒体上的结合从而促进细胞凋亡[34]。Caspase-3是Caspase家族中重要的一员，是一类与细胞密切相关的蛋白水解酶，通过自身活化或相互激活形成活性复合物引起瀑布式的级联反应，导致细胞凋亡，在整个过程中发挥着最后的枢纽作用[35]。本研究结果表明，过表达和抑制表达基因后，猪睾丸支持细胞中Bcl2蛋白表达水平增加，而BAX和Capase-3蛋白表达水平降低，且细胞ATP水平显著增加，细胞凋亡率显著减少。

为进一步解析靶向基因调控猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的信号机制，本文对所有的潜在靶基因进行了功能富集分析，预测出PI3K/AKT信号通路为潜在路径。同时，研究表明，基因与PI3K/AKT信号通路之间具有调控关系。本研究结果表明，过表达和抑制表达基因均可显著促进PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PI3K和AKT的磷酸化水平，且基因同样拮抗对PI3K和AKT蛋白的调控作用。在我们的前期研究中发现，740Y-P激活剂诱导的PI3K/AKT信号通路激活显著促进猪未成熟支持细胞周期进程和细胞增殖，而抑制细胞凋亡[15]，且LY294002抑制剂诱导的PI3K/AKT信号通路减活则显著抑制猪未成熟支持细胞增殖而促进其凋亡[10]。此外，甲状腺激素、促卵泡激素和邻苯二甲酸二丁酯等均可以通过抑制PI3K/AKT信号通路活性抑制支持细胞增殖而促进细胞凋亡[36～38]，17β-雌二醇则通过激活PI3K/AKT信号通路促进支持细胞增殖[39]。同时，[40]、[10]和[41]等均被报道通过调节PI3K/AKT信号通路活性以调控支持细胞增殖和凋亡。因此，PI3K/AKT信号通路的活性可能对于猪未成熟支持细胞的增殖和凋亡具有重要作用。综上所述，靶向基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制其凋亡。

[1] Franca LR, Hess RA, Dufour JM, Hofmann MC, Griswold MD. The Sertoli cell: one hundred fifty years of beauty and plasticity, 2016, 4(2): 189–212.

[2] Rebourcet D, Darbey A, Monteiro A, Soffientini U, Tsai YT, Handel I, Pitetti JL, Nef S, Smith LB, O'Shaughnessy PJ. Sertoli cell number defines and predicts germ and leydig cell population sizes in the adult mouse testis, 2017, 158(9): 2955–2969.

[3] Bertoldo MJ, Guibert E, Faure M, Guillou F, RaméC, Nadal-Desbarats L, Foretz M, Viollet B, Dupont J, Froment P. Specific deletion of AMP-activated protein kinase (α1AMPK) in mouse Sertoli cells modifies germ cell quality, 2016, 423: 96–112.

[4] Ran ML, Chen B, Wu MS, Liu XC, He CQ, Yang AQ, Li Z, Xiang YJ, Li ZH, Zhang SW. Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in development of porcine testes, 2015, 5(78): 63439–63449.

[5] Ding HS, Liu M, Zhou CF, You XB, Su T, Yang YB, Xu DQ. Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in testes of Duroc and Meishan boars, 2020, 21(1): 686.

[6] Luo ZY, Dai XL, Ran XQ, Cen YX, Niu X, Li S, Huang SH, Wang JF. Identification and profile of microRNAs in Xiang pig testes in four different ages detected by Solexa sequencing, 2018, 117: 61–71.

[7] Chen XX, Zheng Y, Li XL, Gao Q, Feng TY, Zhang PF, Liao MZ, Tian XE, Lu HZ, Zeng WX. Profiling of miRNAs in porcine Sertoli cells, 2020, 11: 85.

[8] Ma CP, Song HB, Yu L, Guan KF, Hu PD, Li Y, Xia XY, Li JL, Jiang SW, Li FG. miR-762 promotes porcine immature Sertoli cell growth via the ring finger protein 4 (RNF4) gene, 2016, 6: 32783.

[9] Zhang SX, Guo J, Liang MD, Qi JJ, Wang ZB, Jian XR, Zhang ZB, Sun BX, Li ZH. miR-196a promotes proliferation and inhibits apoptosis of immature porcine Sertoli cells, 2019, 38(1): 41–48.

[10] Gao H, Ran ML, Luo H, Weng B, Tang XW, Chen Y, Yang AQ, Chen B. miR-499 promotes immature porcine Sertoli cell growth by the PI3K/AKT pathway by targeting the PTEN gene, 2019, 152(2): 145–157.

[11] Hu Y, Deng J, Tian K, Yang WR, Luo NJ, Lian Y, Gan L, Tang XY, Luo HY, Zhang JJ, Wang XZ. MiR-8-3p regulates hyperthermia-induced lactate secretion by targeting PPP2R5B in boar Sertoli cells, 2019, 86(11): 1720–1730.

[12] Guo J, Yang C, Zhang SX, Liang MD, Qi JJ, Wang ZB, Peng YH, Sun BX. MiR-375 induces ROS and apoptosis in ST cells by targeting the HIGD1A gene, 2019, 685: 136–142.

[13] Zhang JJ, Wang Y, Yang WR, Kee JD, Wang XZ. MicroRNA-1285 regulates 17β-estradiol-inhibited imma­ture boar Sertoli cell proliferation via adenosine mono­phosphate-activated protein kinase activation, 2015, 156(11): 4059–4070.

[14] Ran M, Li Z, Cao R, Weng B, Peng F, He C, Chen B. miR-26a suppresses autophagy in swine Sertoli cells by targeting ULK2, 2018, 53(4): 864– 871.

[15] Luo H, Chen B, Weng B, Tang XW, Chen Y, Yang AQ, Chu D, Zeng XY, Ran ML. miR-130a promotes immature porcine Sertoli cell growth by activating SMAD5 through the TGF-β-PI3K/AKT signaling pathway, 2020, 34(11): 15164–15179.

[16] Tian F, Yu CT, Wu M, Wu XY, Wan LF, Zhu XJ. MicroRNA-191 promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation by has_circ_0000204/miR-191/KLF6 axis, 2019, 52(5): e12635.

[17] Gao XT, Xie ZQ, Wang ZG, Cheng KL, Liang K, Song ZQ. Overexpression of miR-191 predicts poor prognosis and promotes proliferation and invasion in esophageal squamous cell carcinoma, 2017, 58(6): 1101–1110.

[18] Polioudakis D, Abell NS, Iyer VR. MiR-191 regulates primary human fibroblast proliferation and directly targets multiple oncogenes, 2015, 10(5): e0126535.

[19] Ma CP, Song HB, Guan KF, Zhou JW, Xia XY, Li FG. Characterization of swine testicular cell line as immature porcine Sertoli cell line, 2016, 52(4): 427–433.

[20] Ni FD, Hao SL, Yang WX. Multiple signaling pathways in Sertoli cells: recent findings in spermatogenesis, 2019, 10(8): 541.

[21] Berger T, Nitta-Oda BJ. Sertoli cell proliferation in juvenile boars and microRNA, 2020, 233: 103954.

[22] Kang PC, Leng KM, Liu YP, Liu Y, Xu Y, Qin W, Gao JJ, Wang ZD, Tai S, Zhong XY, Cui YF. miR-191 inhibition induces apoptosis through reactivating secreted frizzled- related protein-1 in cholangiocarcinoma, 2018, 49(5): 1933–1942.

[23] Sharma S, Nagpal N, Ghosh PC, Kulshreshtha R. P53-miR-191-SOX4 regulatory loop affects apoptosis in breast cancer, 2017, 23(8): 1237–1246.

[24] Tian XY, Xu LM, Wang P. MiR-191 inhibits TNF-α induced apoptosis of ovarian endometriosis and endo­metrioid carcinoma cells by targeting DAPK1, 2015, 8(5): 4933–4942.

[25] Varendi K, Kumar A, Härma MA, Andressoo JO. miR-1, miR-10b, miR-155, and miR-191 are novel regulators of BDNF, 2014, 71(22): 4443–4456.

[26] Li HX, Du MQ, Xu WM, Wang ZF. MiR-191 down­regulation protects against isoflurane-induced neuroto­xicity through targeting BDNF, 2021, 31(5): 367–373.

[27] Mohammadipoor-Ghasemabad L, Sangtarash MH, Sheibani V, Sasan HA, Esmaeili-Mahani S. Hippocampal microRNA- 191a-5p regulates BDNF expression and shows correlation with cognitive impairment induced by paradoxical sleep deprivation, 2019, 414: 49–59.

[28] Trumpp A, Refaeli Y, Oskarsson T, Gasser S, Murphy M, Martin GR, Bishop JM. c-Myc regulates mammalian body size by controlling cell number but not cell size, 2001, 414(6865): 768–773.

[29] Ramana KV, Tammali R, Srivastava SK. Inhibition of aldose reductase prevents growth factor-induced G1-S phase transition through the AKT/phosphoinositide 3-kinase/ E2F-1 pathway in human colon cancer cells, 2010, 9(4): 813–824.

[30] Blum Y, Mikelson J, Dobrzynski M, Ryu H, Jacques MA, Jeon NL, Khammash M, Pertz O. Temporal perturbation of ERK dynamics reveals network architecture of FGF2/ MAPK signaling, 2019, 15(11): e8947.

[31] Strzalka W, Ziemienowicz A. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a key factor in DNA replication and cell cycle regulation, 2011, 107(7): 1127–1140.

[32] Duval N, Vaslin C, Barata TC, Frarma Y, Contremoulins V, Baudin X, Nedelec S, Ribes VC. BMP4 patterns Smad activity and generates stereotyped cell fate organization in spinal organoids, 2019, 146(14): 175430.

[33] Volkmann N, Marassi FM, Newmeyer DD, Hanein D. The rheostat in the membrane: Bcl-2 family proteins and apoptosis, 2014, 21(2): 206–215.

[34] Correia C, Lee SH, Meng XW, Vincelette ND, Knorr KLB, Ding HS, Nowakowski GS, Dai HM, Kaufmann SH. Emerging understanding of Bcl-2 biology: implications for neoplastic progression and treatment, 2015, 1853(7): 1658–1671.

[35] Savitskaya MA, Onishchenko GE. Mechanisms of apoptosis, 2015, 80(11): 1393–1405.

[36] Riera MF, Regueira M, Galardo MN, Pellizzari EH, Meroni SB, Cigorraga SB. Signal transduction pathways in FSH regulation of rat Sertoli cell proliferation, 2012, 302(8): E914–E923.

[37] Sun Y, Yang WR, Luo HL, Wang XZ, Chen ZQ, Zhang JJ, Wang Y, Li XM. Thyroid hormone inhibits the proliferation of piglet Sertoli cell via PI3K signaling pathway, 2015, 83(1): 86–94.

[38] Wang C, Zheng P, Adeniran SO, Ma MJ, Huang FS, Adegoke EO, Zhang GX. Thyroid hormone (T3) is involved in inhibiting the proliferation of newborn calf Sertoli cells via the PI3K/Akt signaling pathway in vitro, 2019, 133: 1–9.

[39] Yang WR, Zhu FW, Zhang JJ, Wang Y, Zhang JH, Lu C, Wang XZ. PI3K/Akt activated by GPR30 and Src regulates 17β-estradiol-induced cultured immature boar Sertoli cells proliferation, 2017, 24(1): 57–66.

[40] Hu PD, Guan KF, Feng Y, Ma CP, Song HB, Li Y, Xia XY, Li JL, Li FG. miR-638 inhibits immature Sertoli cell growth by indirectly inactivating PI3K/AKT pathway via SPAG1 gene, 2017, 16(23): 2290–2300.

[41] Luo H, Peng FZ, Weng B, Tang XW, Chen Y, Yang AQ, Chen B, Ran ML. miR-222 suppresses immature porcine Sertoli cell growth by targeting the GRB10 gene through inactivating the PI3K/AKT signaling pathway, 2020, 11: 581593.

MiR-191 promotes the porcine immature Sertoli cell proliferation by targeting thegene through activating the PI3K/AKT signaling pathway

Xiangwei Tang, Dan Chu, Saina Yan, Yanfei Yin, Qiao Bian, Bo Weng, Bin Chen, Maoliang Ran

The number of Sertoli cells in the testis is a major regulator on the sperm production capacity. MicroRNAs (miRNAs) participate in regulating the proliferation and apoptosis of porcine immature Sertoli cells. However, the functions and mechanisms of action of most identified miRNAs in porcine Sertoli cells remain largely unknown. In the present study, based on our previous results from an EdU-based high-content screening assay, we further studied the mechanism of action ofon the proliferation and apoptosis of porcine immature Sertoli cells through flow cytometry, Western blotting, and dual-luciferase activity analyses. The results demonstrated that overexpression ofpromoted cell cycle progression from G1phase to the S and G2phases, enhanced cell proliferation, and inhibited apoptosis in the porcine immature Sertoli cells, whereasinhibition resulted in the opposite effects. The results from a luciferase reporter assay showed thatdirectly targeted the 3′-UTR of thegene.knockdown also promoted cell cycle progression to the S phase, cell proliferation and inhibited cell apoptosis, which were consistent with the effects of theoverexpression. A co-transfection experiment showed thatknockdown abolished the effects ofinhibition. Furthermore, bothoverexpression andinhibition elevated the phosphorylation of PI3K and AKT, the key components of the PI3K/AKT signaling pathway, whereasinhibition offset the effects of theknockdown. Overall, these data indicated thatpromotes cell proliferation and inhibits apoptosis in porcine immature Sertoli cells by targeting thegene through activating the PI3K/AKT signaling pathway. This study provides a novel scientific basis for further investigation on the biological functions ofon porcine spermatogenesis.

;gene; PI3K/AKT signaling pathway; proliferation; porcine Sertoli cells

2021-04-25;

2021-06-02

湖南省自然科学基金项目(编号：2020JJ4348)，湖南省重点研发计划项目(项目编号：2020NK2024)和湖南省生猪产业技术体系岗位专家项目资助[Supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (No. 2020JJ4348), the Key Research and Development Plan Projects of Hunan Province(No. 2020NK2024), and the Project from Porcine Industry and Technology System of Hunan Province]

唐湘薇，在读硕士研究生，专业方向：猪遗传育种。E-mail: 993808546@qq.com

冉茂良，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：猪遗传育种。E-mail: ranmaoliang0903@126.com

陈斌，博士，教授，博士生导师，研究方向：猪遗传育种。E-mail: chenbin7586@126.com

10.16288/j.yczz.21-154

2021/6/11 17:50:36

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210611.1452.002.html

(责任编委: 李明洲)