不同种源木姜叶柯活性成分差异与气候土壤因子的耦合研究

杨 旭，杨志玲，王依清

（1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400；2.湖南翱康生物科技有限公司，湖南 溆浦 419300）

木姜叶柯Lithocarpus litseifolius，又名多穗柯、甜茶、胖稠，为壳斗科Fagaceae 柯属Lithocarpus植物，广泛分布于我国长江以南地区[1]。木姜叶柯的使用历史可追溯到南北朝南朝刘宋景平元年。《本草纲目》记载，木姜叶柯“气味甘、平，无毒，疗痔，止血及血痢，止渴，活血，利小便”[2]。现代药理研究表明，木姜叶柯叶片中含有多种营养成分和药效成分，包括多种黄酮类、三萜类、甾体及丰富的氨基酸和微量元素。其主要成分包括根皮苷、三叶苷等二氢查耳酮类化合物[3]。该类化合物的甜度为蔗糖的300 倍，热量仅为蔗糖的三百分之一，是一类高甜、低热、无毒性的天然甜味剂，具有甜度大、甜味清爽愉悦、后味持续时间长，在水中可溶稳定的特点[4]。二氢查尔酮类还具有良好的药理作用，其糖苷基在体内发生水解，却几乎不参与代谢，因此对肥胖病患者和糖尿病人来说显得尤为重要[5]。该类化合物是钠－葡萄糖转运蛋白（SGLTs 和GLUTs）的竞争性抑制剂，能抑制葡萄糖在肾脏的重吸收，进而控制血糖，干预糖尿病、肾病的发生和发展，还可通过与心脏中β-肾上腺素受体结合，使心肌收缩力、心率明显增加；还可以促进葡萄糖的分泌、降低空腹和餐后血糖水平，而不发生低血糖副作用[6-7]。

由于木姜叶柯良好的药用价值，国内外学者对其有效成分[3]、药理作用[6-8]、提取工艺[9]等方面开展了细致的研究，并通过转录组数据的分析而对其有效成分合成的关键基因进行了挖掘[10]。但木姜叶柯不是传统意义上的药用植物，没有被收入《中国药典》，作为保健品开发也是近年的事，对其质量评价缺乏统一有效的指标，对原料缺乏有效的监管，导致市场上的原料来源混乱，严重阻碍了木姜叶柯产业的进一步发展。因此，加强木姜叶柯不同种源有效成分差异的研究，确定其质量控制的关键成分具有重要的意义。本研究分析了我国木姜叶柯主要产区不同种源木姜叶柯叶片中主要有效成分的含量差异，以期为该物种的保护、发展和可持续利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2019年4—5月选择了9 个木姜叶柯天然种群，每个种群采集10 个健康、成熟的植株，由中国林科院亚热带林业研究所杨志玲研究员鉴定为壳斗科植物木姜叶柯。每个植株分东、南、西、北四个方向分别采集当年生新稍上的幼嫩叶片和往年生枝条上的成熟叶片各10 枚。各采集地的地理气候因子见表1。采集地的经纬度和海拔高度用手持式GPS 记录，采集地气候因子来源与中国气象科学数据共享中心平台。

1.2 实验方法

1.2.1 木姜叶柯根际土壤营养元素测定

采集木姜叶柯栽培地0～20 cm 土层的土壤，按照中华人民共和国林业行业标准1238—1999、1228—1999、1232—1999、1234—1999、1237—1999分别测定土壤中pH值、土壤全氮、全磷、全钾、土壤速效氮、速效磷、速效钾及土壤有机质[11]含量。

1.2.2 木姜叶柯叶片有效成分含量的测定

将木姜叶柯叶片60℃烘干至恒质量，粉碎，过40 目筛。用高效液相色谱法测定木姜叶柯叶片中根皮苷（Phlorizin）[12]、三叶苷（Trilobatin）[12]、新橙皮苷二氢查尔酮（Neosperidin dihydrochalcone）[13]、根皮素（Phloretin）[14]含量，用紫外分光光度法测定木姜叶柯叶片中总黄酮含量[15]。

1.3 数据分析

运用SPSS 19.0 统计软件对不同种源木姜叶柯叶片有效成分含量做多重比较及方差分析，并对木姜叶柯有效成分含量与环境因子作相关分析，对不同种源木姜叶柯的有效成分含量进行综合评价。

2 结果与分析

2.1 不同种源木姜叶柯当年生叶片有效成分含量差异

对不同种源当年生叶片中有效成分含量分析可知（表3），不同种源木姜叶柯当年生叶片中根皮苷平均含量为1.76%，其中江西安福种源含量最高，为3.53%，四川芦山根皮苷含量最低，为0.60%；各种源当年生叶片中三叶苷的平均含量为5.90%，其中重庆梁平种源含量最高，达19.91%，广西巴马种源含量最低，为1.51%；各种源当年生叶片中新橙皮苷二氢查尔酮的平均含量为0.31%，其中重庆梁平种源含量最高，为1.25%，重庆酉阳种源含量最低，为0.02%；各种源当年生叶片中根皮素的平均含量为0.53%，其中湖北利川种源含量最高，为4.03%，四川芦山种源含量最低，为0.01%；各种源当年生叶片中总黄酮含量平均为3.61%，其中重庆梁平种源含量最高，为7.41%，湖南溆浦种源含量最低，为2.27%。除根皮苷外，各种源当年生叶片中有效成分含量差异均达到显著水平。

木姜叶柯当年生叶片中5 个有效成分的含量差异在9 个种源间达到了显著或极显著水平，而除了根皮苷含量外，其他几种成分在各种源内的差异并未达到显著水平（表4）。各有效成分中，根皮苷、新橙皮苷二氢查耳酮和根皮素的变异主要来源于种源内单株间及单株内，种源间的方差分量从5.69～11.91%不等，而三叶苷和黄酮的主要变异来源于种源间及单株内，种源间的方差分量分别为48.31 和33.75%（表3）。

表2 不同种源木姜叶柯土壤养分状况Table 2 Soil nutrition of different L.litseifolius provenances

表3 不同种源木姜叶柯当年生叶片有效成分含量Table 3 Content of current-year leaves of different L.litseifolius provenances

表4 不同种源木姜叶柯当年生叶片中有效成分的方差分析Table 4 Variance analysis of the current-year leaves content of different L.litseifolius provenances

2.2 不同种源木姜叶柯往年生叶片有效成分含量差异

对不同种源往年生叶片有效成分含量差异分析可知（表5），不同种源木姜叶柯往年生叶片中根皮苷含量平均为10.99%，其中含量最高的是重庆酉阳种源，达到20.71%，含量最低的是湖北利川种源，为5.92%；不同种源往年生叶片三叶苷平均含量为0.26%，其中含量最高的是重庆梁平种源，为0.58%，含量最低的是四川芦山种源，为0.09%；不同种源往年生叶片中新橙皮苷二氢查尔酮的平均含量为0.011%，其中含量最高的是重庆梁平种源，为0.023%，含量最低的是四川芦山种源，为0.005%，不同种源往年生叶片中根皮素平均含量为0.016%，其中含量最高的是湖北长阳种源，为0.057%，含量最低的为湖南芷江种源，为0.007%；不同种源往年生叶片中总黄酮的平均含量为6.39%，其中含量最高的是重庆酉阳种源，为9.68%，含量最低的是四川芦山，为3.34%。各种源不同成分的含量差异均达到极显著水平。由表3和表5可知，往年生叶片中根皮苷和黄酮含量显著高于当年生叶片，但三叶苷、新橙皮苷二氢查尔酮和根皮素含量显著低于当年生叶片。

木姜叶柯往年生叶片中5 个有效成分中三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮和根皮素的含量差异在9个种源间达到了极显著水平，而根皮苷和黄酮的含量在种源间，及5 种成分在种源内均未达到显著水平（表6）。各有效成分变异的主要来源于单株内，种源间的方差分量从6.34%～13.42%不等，而种源内单株间的方差分量从1.12%～16.12%不等（表5）。

表5 不同种源木姜叶柯往年生叶片有效成分含量差异Table 5 Content of former-year leaves of different L.litseifolius populations

表6 木姜叶柯往年生叶片有效成分的方差分析Table 6 Variance analysis of the former-year leaves content of different L.litseifolius populations

2.3 木姜叶柯叶片主要化学成分与地理气候及土壤因子的相关分析

对不同种源木姜叶柯叶片化学成分与地理气候及土壤因子的相关分析可知（表7～8），当年生叶片中三叶苷、新橙皮苷二氢查尔酮及根皮素含量与纬度呈显著负相关，三叶苷和根皮素含量与年均温和极端最低温度呈显著的正相关，叶片中总黄酮含量与土壤中pH 值含量呈显著负相关。往年生叶片中根皮素含量与维度呈显著的负相关，与年均温呈显著的正相关，与极端最低温度呈显著的正相关，三叶苷含量与极端最高温度呈显著的正相关，此外，根皮苷含量与土壤中有机质含量、土壤全氮和速效氮含量成显著的正相关，三叶苷含量与土壤有机质含量和土壤全磷含量呈显著的正相关，叶片中总黄酮含量与土壤pH 值呈显著的负相关，其余化学成分含量与各地理气候及土壤因子不存在显著的相关性。

表7 木姜叶柯当年生叶片与地理气候土壤因子的相关性分析Table 7 Ccorrelation of the current-year leaves content and geographic,meteorological and soil factors in L.litseifolius populations

3 结论与讨论

3.1 讨 论

1）根皮苷、根皮素、三叶苷及新橙皮苷二氢查尔酮属于二氢查尔酮类化合物，其中根皮苷、根皮素及三叶苷最早来源于苹果属植物[16]，新橙皮苷二氢查尔酮最初是从天然柑橘类植物中提取的黄烷酮再合成的[4]。根皮苷、根皮素及三叶苷在苹果属Malus叶片中的含量分别为1.01～17.15%、0～0.09% 以及0～1.50%[16]，而以上化合物在木姜叶柯中的含量分别达到0.46～18.49%、0.01～4.03%和0.10～19.91%，除根皮苷外，其余两种化合物的含量显著高于苹果属植物。此外，柑橘类植物中仅能提取新橙皮苷和柚皮苷，再通过开环氢化合成新橙皮苷二氢查尔酮[17]。而木姜叶柯叶片中新橙皮苷二氢查尔酮不需要化学合成，可直接提取获得，且含量可达0.01～1.25%，具有简便、高效的特点。

表8 木姜叶柯往年生叶片与地理气候土壤因子的相关性分析Table 8 correlation of the former-year leaves content and geographic,meteorological and soil factors in L.litseifolius populations

2）木姜叶柯叶片有效成分含量在种源间具有较大的差异，方差分析结果显示，当年生叶片中根皮苷、根皮素、三叶苷和新橙皮苷二氢查尔酮含量均存在着极大的变异，变异系数在93.43～325.81之间，往年生叶片中各有效成分含量的变异系数有所降低（变异系数在43.69～88.86%之间），但仍远高于杜仲Eucommia ulmoides叶片中槲皮素、异槲皮苷、多酚和总黄酮的变异系数（分别为42.42%、34.42%、23.72%和19.35%）[18]，以及黄栀子Gardenia jasminodes果实中栀子酸、绿原酸、藏红花素和栀子苷的变异系数（分别为22.42%、20.20%、8.01、17.26%和14.79%）[19]。表明不同种源木姜叶柯存在丰富的遗传变异，可为种源的收集、分类和良种选育提供理论依据。

3）木姜叶柯叶片中有效成分含量的含量存在着显著的地区性差异。对木姜叶柯叶片有效成分与各种可能影响其含量的生态因子的相关分析表明，多数次生代谢产物的含量与纬度呈显著的负相关，与温度呈显著的正相关，表明高温有利于次生代谢产物的积累，这与对黄芩Scutellaria baicalensis[20]、野鸭椿属Euscaphis[21]等植物的研究结果相似。但木姜叶柯中的主要次生代谢产物二氢查耳酮类化合物，其主要合成的关键基因包括查耳酮合成酶、查耳酮异构酶、异黄酮合成酶[10]。研究表明，低温能造成该类基因表达上调，从而促进这些二氢查耳酮类的合成和积累[22-23]。但我们的研究发现，木姜叶柯叶片有效成分含量与年均温呈显著正相关，这可能是由于木姜叶柯主要分布在我国的低纬度地区，不能耐受极端的低温天气，低温造成查耳酮合成酶基因表达的下调，造成二氢查耳酮类化合物积累的减少[24]，从而造成其对温暖的气候条件的选择性适应，研究发现，低温处理能使银杏叶片中黄酮含量显著下降[25]。土壤中的营养元素对当年生叶片的影响不明显，但对往年生叶片中的根皮苷、三叶苷等成分的影响较大。土壤中的营养元素会影响次生代谢产物的含量，这在许多植物中都得到了验证[21,26]。植物次生代谢产物合成的影响因素很多，合成酶的启动需要一定的时间，许多基因的表达是在植物生长的特定时期，如四棱豆Psophocarus tetragonolobus的繁殖器官中，成熟的种子的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性要显著高于幼嫩的豆荚[27]。土壤中的营养元素能增强许多合成酶的活性，从而促进次生代谢产物的合成。研究表明，对元宝枫Acer truncatum增施钾肥能促进叶片中花色苷的含量[28]，而土壤中的腐殖质和微量元素能促进金线莲Anoectochilus formosanus中槲皮素、山奈酚、异鼠李素的积累[29]。木姜叶柯往年生叶片中根皮苷、三叶苷等成分与土壤有机质及土壤含氮量显著正相关，可能是由于它们增强了二氢查耳酮类化合物合成的关键酶的活性造成的。

3.2 结 论

本研究探讨了不同种源木姜叶柯叶片当年生和往年生叶片有效成分的含量差异。结果表明，木姜叶柯叶片中活性成分的含量存在着显著的地区差异，其中江西安福、重庆梁平等种源叶片有效成分含量较高，以上结论为为木姜叶柯引种及高品质木姜叶柯品种的选育及提供依据。同时，分析叶片有效活性成分含量与纬度、年均温、极端最低温度及土壤pH 值、土壤有机质、土壤含氮量等因素密切相关。因本文所用的材料为木姜叶柯天然群体的叶片，其次生代谢产物的含量除了受到遗传因素的控制外，还受到诸如群落类型、林地小气候、地表覆盖物等诸多因素的影响。为了精准地找到木姜叶柯有效成分的综合决定因子，进行同质栽培试验就显得尤为重要。笔者希望通过木姜叶柯标准化栽培技术的研究，再结合其园艺性状和植物成分的综合分析，为实现木姜叶柯资源的培育和高效利用提供理论支持。