基于网络药理学探讨三七-蒲黄药对治疗冠心病的作用机制

张嘉芮，徐京育

冠心病是冠状动脉粥样硬化和(或)功能改变(如痉挛)导致的心肌血液供应减少或中断而产生的一组临床症候群。年龄、性别、吸烟、饮酒、高脂血症、高血压、糖尿病等均为冠心病的危险因素[1]。目前，西医治疗冠心病常用药物为硝酸酯类、他汀类、醛固酮受体拮抗剂、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂[2]，然而这些药物在临床上可能会引起严重的不良反应，如头痛、眩晕、肝肾功能衰竭、心动过缓等。中药具有对机体整体调节的功能以及较少的不良反应[3]，可明显改善冠心病病人预后。冠心病属中医学“胸痹”“真心痛”范畴，基本病机为心失所养、心脉痹阻[4]。活血化瘀、益气活血为常用中医治法。三七具有散瘀止血、消肿定痛的功效，临床上常用于冠心病、脑血管疾病、神经症、肺心病的治疗。三七皂苷等活性物质具有抗凝、抑制血小板聚集、促进纤溶、扩张冠状动脉、抗炎、镇痛、镇静等作用[5]。蒲黄功效为化瘀、止血、通淋，其含有黄酮类、固醇类，具有抗凝、扩张血管、改善微循环、降压、降血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化的作用[6]。网络药理学是基于系统生物学的理论[7]，通过“药物-基因-靶点-疾病”之间相互作用网络，系统地观察药物对疾病网络的干预和影响[8]，与中医学“整体观念”“异病同治”相似[9]。本研究通过网络药理学研究方法探讨三七-蒲黄药对治疗冠心病的可能分子作用机制，为中医药治疗冠心病的后续研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 活性成分的挖掘与筛选 利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)将三七、蒲黄两味中药分别输入TCMSP数据库进行化学成分分析检测，以口服生物利用度(OB)≥30%及药物相似性(DL)≥0.18作为筛选条件，对化合物进行筛选，获得药物活性成分及对应靶点。

1.2 疾病靶点的查找 以“coronary heart disease”为关键词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)和NCBI基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=)进行检索，并删除重复基因。NCBI数据库设置为人类基因。

1.3 药物疾病核心靶点的获取 将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入Venny 2.1软件制作韦恩图，并获取药物及疾病共有靶点。

1.4 作用靶点的筛选及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 将药物疾病共有靶点输入String数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI网络构建，将PPI网络导入Cystoscape 3.6.0中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以连接度(degree)、中介中心性(betweenness centrality)、平均最短路径长度(average shortest path length)和接近中心性(closeness centrality) 4个参数为参考标准，通过degree值排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，使用R 3.6.3绘图。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络的构建 通过MCODE分析进行关键基因的筛选。将已经构建好的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2中，打开MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析 将药物疾病共有靶点进行生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cell component，CC)富集。

1.7 京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，采用String数据库，筛选三七-蒲黄药对治疗冠心病的主要作用通路。

2 结 果

2.1 三七、蒲黄活性成分与相关靶点的筛选 在TCMSP数据库中检索三七、蒲黄，收集其化学成分以及靶点信息，设定成分筛选条件为OB≥30%、DL≥0.18，对所有成分进行筛选，三七得到7个活性成分、55个靶点；蒲黄得到8个成分、198个靶点。将两者靶点删除去重后，筛选出211个药物靶点。部分三七-蒲黄药物靶点见表1。

表1 部分三七-蒲黄药物靶点

2.2 疾病靶点筛选 以“coronary heart disease”为关键词，在GeneCards和NCBI基因数据库进行检索，NCBI数据库设置为人类基因。经过检索，在GeneCards数据库检索到6 812条相关基因，NCBI基因数据库得到364个基因。将这两个数据库的基因合并去重后，得到6 812个冠心病相关基因。

2.3 药物-疾病核心靶点获取 将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入Venny 2.1软件构建韦恩图，得到181个共有靶点。详见图1。

图1 三七-蒲黄-冠心病靶点韦恩图

2.4 PPI网络构建及拓扑分析 将药物-疾病共有靶点输入String数据库构建PPI网络。详见图2。将PPI网络导入Cystoscape 3.6.0中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以连接度、中介中心性、平均最短路径长度和接近中心性4个参数为参考标准，通过连接度值排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，共筛选出66个关键靶点。

图2 PPI网络图

2.5 药物-成分-靶点-疾病网络的构建 通过MCODE分析进行关键基因的筛选。将已经构建好的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2中，打开MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。核心靶点见图3。共得到8个基因簇和8个核心基因，核心基因为ESR1、MYC、BCL2、CYP1B1、KCNH2、OPRM1、CHRM2、ENSG00000196689。详见图4。以纳入的复方中药、对应的中药成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了中药-成分-靶点-疾病网络图。详见图5。

图3 核心靶点柱状图

图4 核心基因

图5 三七-蒲黄-成分-靶点-冠心病网络图

2.6 GO富集分析 共富集到2 242条生物过程，176个分子功能，81个细胞组分。包括对脂多糖的反应、对类固醇激素的反应、活性氧代谢过程、核受体活动、金属离子反应、酮反应、转录因子复合体等。使用R 3.6.3绘制气泡图(见图6)和柱状图(见图7)。

图6 三七-蒲黄靶点的GO富集分析气泡图

图7 三七-蒲黄靶点的GO富集分析柱状图

2.7 KEGG通路富集 共富集到166条信号通路。使用R 3.6.3 绘制柱状图(见图8)和气泡图(见图9)。

图8 三七-蒲黄靶点的KEGG富集分析柱状图

图9 三七-蒲黄靶点的KEGG富集分析气泡图

3 讨 论

冠心病属中医学“胸痹”“真心痛”范畴，《金匮要略》认为其病机为“阳微阴弦”[10]，气虚血瘀作为冠心病的基本病机，气虚多因年老体衰致血液迟滞脉中，使濡润机体的阴液不足，可见阴虚之象。气虚不运，血滞脉中，气机升降失司，易形成气机郁滞。血瘀则心脉痹阻则发胸痹。《素问·痹论》[11]有“痹者，脉不通”“痹在于脉则血凝而不流”“脉者，血之府也，涩则心痛”的论述。皇甫谧《针灸甲乙经》首次明确指出瘀血可致胸膈满痛(即胸痹)，“胸中瘀血，胸胁榰满，膈痛”[12]。历代医家则提出了很多瘀血与胸痹的理论，如《继志堂医案》中“胸痛彻背，是名胸痹……且有血交阻隔间”；《医学正传》中“污血充心”；《脉因证治》中“胸痹之因，痰凝血滞是也”[13]。近代许多研究也证实了冠心病与瘀血有密切联系，血瘀证贯穿于冠心病发生发展的全过程，故治疗多以益气活血化瘀为主。三七-蒲黄均属活血化瘀类药物。三七归肝、胃经，具有化瘀止血、消肿定痛的功效，可化瘀生新，《玉楸药解》中指出三七可“和营止血，通脉行瘀，行淤血而敛心血”。蒲黄归心、肝经，可凉血止血、活血消瘀[14]。有研究表明蒲黄可抗凝、扩张血管、增加冠状动脉血流[15]。在临床上二者常相须为用。本研究通过网络药理学分析三七-蒲黄药对治疗冠心病的可能分子机制。

本研究通过对三七、蒲黄有效成分的分析，构建了药物-成分-靶点-疾病网络。网络中的关键化学成分为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷Rh2、人参皂苷f2等。其中槲皮素在网络中的连接度值(126)远高于其他化学成分，由此可推断三七-蒲黄药对是治疗冠心病中发挥疗效的最关键成分。槲皮素是三七、蒲黄中均含有的一种黄酮类化合物[16-17]。有研究证明槲皮素具有扩张血管、降血压、增加血流灌注、防治冠心病、抗炎、抗氧化、减轻心脏肥厚、抑制血管平滑肌细胞增生肥大、防治心肌缺血再灌注损伤、抗血栓形成等多种心血管保护作用[18]。根据药物-成分-靶点-疾病网络分析示蛋白激酶B1(AKT1)、白细胞介素-6(IL6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、半胱氨酸蛋白酶3基因(GASP3)等连接度值较高(>95)，是治疗冠心病的关键作用靶点。其中AKT1是蛋白激酶B(AKT)中的一种，通过一系列下游底物来调节机体代谢、细胞存活、生长和血管生成过程[19]。AKT通过激活AS160和PFKFB2来调节体内脂肪、氨基酸等物质的代谢。VEGFA是血管内皮生长因子(VEGF)中参与血管新生的主要调控因子，VEGF是血管内皮细胞生长刺激因子，能特异性地作用于血管内皮细胞，促进侧支循环的形成[20]。IL6是一种多肽，作为重要的炎性因子，具有广泛的生物学作用，在冠心病发生发展中发挥重要作用。冠心病发生发展中，巨噬细胞、内皮细胞在局部损伤因素作用下，释放大量IL6，促进心血管局部斑块发生发展，加重局部血管闭塞。有研究指出，IL6不仅可以加重疾病进展，还能通过超敏C反应蛋白诱导低密度脂蛋白结合，以及与单核-巨噬细胞相应受体结合造成血管内皮细胞损伤，诱导血小板聚集，形成不稳定斑块[21]。本研究GO和KEGG富集分析结果主要涉及白细胞介素17(IL17)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、Th17细胞分化、C型凝集素受体信号通路。TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，可引起血管内皮损伤，导致内皮功能障碍，还能促进炎性因子IL6的表达，参与血管平滑肌细胞的增殖分化和调控，从而使血管壁增厚、管腔狭窄、外周阻力增高，促进高血压形成。C型凝集素受体可识别多种病原体，与感染性疾病相关[22]。有研究表明，槲皮素等黄酮类化合物可促进AKT1的激活，并使IL6、TNF-α活性降低。

4 小 结

本研究采用网络药理学研究方法探讨三七-蒲黄药对治疗冠心病的多种作用靶点、作用通路及潜在机制。研究结果显示，三七、蒲黄中的槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷Rh2、人参皂苷f2等主要活性成分可能通过IL17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化、C型凝集素受体信号通路作用于AKT1、IL6、VEGFA、GASP3等关键靶点，来发挥其抗炎、抗病毒、免疫调节等作用。希望今后能有更完善的理论、实验和临床研究对以上结论进行验证，为三七-蒲黄药对治疗冠心病提供更有效的依据。