基于网络药理学和分子对接技术探讨糖足1号方治疗糖尿病足的机制

陈盛业 甘宇

沈阳市第七人民医院 沈阳 110000

糖尿病足（diabetic foot，DF）是糖尿病常见而严重的慢性并发症，由于周围神经病变、外周血管疾病、合并细菌感染等多种因素，引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形[1-2]，表现为患处缺血、感染、坏疽，可并发溃疡、骨髓炎、Charcot关节病等[3-5]。目前临床对于DF的治疗原则为控制血糖、抗感染和手术治疗[6-8]，但在临床很多患者伴有其他合并症，不符合手术标准，导致治疗方法局限，影响治疗效果。

DF可归属于中医“脱疽”或“筋疽”范畴。《疡科心得集》云：“惟足背多筋少骨，肉少皮薄……若初起寒热作呕，坚硬红肿，疼痛作脓者，属湿热，为可治。”[9]当代医家奚九一将DF分为急性发作期、好转缓解期和恢复期三期，急性发作期患足漫肿灼热伴全身发热，常辨为湿热证或湿毒证，应用清热利湿解毒之清法治疗效果佳[10-11]。糖足1号方由沈阳市第七人民医院自备，为《千金翼》中三黄汤基础上加入苦参而成，功效重在清热燥湿。研究证实，三黄汤能够提高DF患者保肢率，缓解溃疡症状，促进创面愈合[12]。本文针对本方的分子作用机制进行研究，基于网络药理学和分子对接的方法对方中药物的化学成分进行筛选，探求其治疗DF的靶点及信号通路，并以动物实验进行验证，为进一步研究验方的作用机制提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 糖足1号方有效化学成分筛选 糖足1号方由黄芩、黄连、黄柏、苦参4味中药组成。登录中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分别对以上4味中药的有效成分进行查询，检索标准设定为口服生物利用度 （oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18。 OB是指药物被吸收进入人体循环的速度与程度；DL为类药性，反映化合物中的特定功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。

1.2 糖足1号方与DF的共同靶点筛选 应用TCMSP数据库找出糖足1号方中关键化学成分所对应的靶点蛋白，通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白-人类基因名称转换，使用基因组注释数据 库 平 台（genome annotation database platform，GeneCards）（https://www.genecards.org/）搜索DF所对应的疾病靶点基因，将搜索到的靶点基因与药物靶点进行一一映射，得到药物-疾病靶点基因及与之对应的关键化学成分。

1.3 化学成分-靶点网络构建 将药物关键化学成分与疾病的共同靶点基因整理成为基因列表、化合物列表、网络关系等文件，将上述文件导入Cytoscape 3.7.2软件，进行图像可视化处理，将关键化学成分与共同靶点基因之间的关系以网络图的形式呈现出来。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建 将糖足1号方与DF的共同靶点蛋白输入String数据库平台（https://string-db.org/Version 10.5），选择研究物种为人类（Homo sapiens），设置PPI评分＞0.4，得到PPI网络，其中不同颜色代表不同证据关系。下载PPI关系图和关系数据，筛选出前15位的PPI网络核心基因。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通过Bioconductor数据库（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查询药物-疾病共同靶点基因的基因身份（identification，ID）。安装Bioconductor平台相关安装包，设置P=0.05，q=0.05，进行GO富集分析和KEGG富集分析，输出结果并绘制柱状图，再运用Cytoscape 3.7.2软件构建靶点-信号通路网络图。

1.6 分子对接 通过有机小分子生物活性数据库（PubChem）中的标识符（identifier from database of chemical，CID）下载关键化学成分结构，并通过Chemdraw软件对其结构进行3D优化。通过程序数据库（Program Database File，PDB） （http://www.rcsb.org/）下载靶蛋白的结构，并使用PyMOL软件进行常规预处理，随后使用AutoDock软件进行分子对接，对接参数均为默认值。

1.7 验证性实验

1.7.1 实验动物及分组 30只无特定病原体（specified pathogen free，SPF）级健康雄性Wistar大鼠，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司[实验动物生产许可证号码：SCXK （辽）2015-0001]，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心[实验动物使用许可证号码：SYXK（辽）2013-0009]。大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法随机分为3组，每组10只，分别为正常组、模型组、中药组。需要造模的大鼠（模型组、中药组）采用高脂饲料喂养2个月，禁食16h后，以45mg·kg-1的剂量腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），STZ以0.1mol·L-1、pH为4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成10mg·mL-1溶液；正常组以普通饲料喂养2个月，腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。1周后造模组剔除无多饮、多尿表现，体质量无明显减少，空腹血糖＜16.7mmol·L-1的大鼠。糖尿病造模完成2周后，行股动脉多普勒超声检测。选择造模组中出现动脉粥样硬化改变的大鼠与正常组大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠50mg·kg-1麻醉，足背部消毒后以印章作3mm×7mm的矩形标记，切除其全层皮肤，每天用0.5%碘伏消毒创面。将造模组大鼠分为中药组和模型组，中药组大鼠给予糖足1号方药膏擦涂足背创面，2次/d，共4周；模型组和正常组大鼠不予干预，观察4周。

1.7.2 检测指标 各组均于腹腔注射后3、7、14、21d进行血糖测定，记录体质量、平均饮水量，观察垫料湿度粗测尿量；STZ注射后第21天两组（模型组、中药组）行双侧股动脉多普勒检测，记录两组溃疡愈合时间；溃疡形成后第10天两组各随机选择1只大鼠，腹主动脉取血，并切取大鼠足背部病变及周围全层皮肤，以酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测大鼠白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARG）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）水平。

1.8 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖足1号方的有效化学成分 糖足1号方由黄芩、黄连、黄柏、苦参组成，通过OB≥30%、DL≥0.18标准对各药物的化学成分进行筛选，共得到132个有效化学成分，其中黄芩36个、黄连14个、黄柏37个、苦参45个。见表1。

表1-1 糖足1号方的有效化学成分Tab.1-1 The active chemical composition of Tangzu No.1 prescription

表1-2 糖足1号方的有效化学成分Tab.1-2 The active chemical composition of Tangzu No.1 prescription

2.2 药物-疾病共同靶点 打开GeneCards和在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库，输入“diabetic foot”，得到疾病靶点基因，筛选出评分≥20的靶点基因共225个，将其与药物靶点基因进行对应，得到药物-疾病共同靶点基因共29个；将共同靶点与药物有效化学成分进行对应，得到糖足1号方治疗DF的关键化学成分共33个。见表2。

表2 药物-疾病共同靶点基因Tab.2 Drug-disease common target genes

2.3 关键化学成分-靶点网络构建 应用Cytoscape 3.7.2软件将药物-关键化学成分-疾病-靶点基因网络进行可视化处理。图中矩阵代表靶点，圆圈代表化合物，其中不同颜色代表化合物来源于不同的药物。其中药物活性成分以“degree”表示，排名前5的关键化学成分为槲皮素（quercetin，MOL000098，degree=28）、汉黄芩素 （wogonin，MOL000173，degree=7）、 黄芩素（baicalein，MOL002714，degree=7）、 脱氢丹参酮ⅡA（dehydrotanshinone Ⅱ A，MOL002651，degree=3）、吴茱萸次碱（rutaecarpine，MOL002662，degree=3）。 见图1。

图1 关键化学成分-靶点网络Fig.1 The key chemical component-target network

2.4 PPI分析 打开String数据库平台，导入29个共同靶点基因，选择研究物种为人类，获取PPI，选择评分＞0.4的蛋白关系，并绘制PPI网络图。见图2。该网络包括29个节点，226条边，其中评分≥0.99的互作蛋白为AKT1-NOS3、IGF2-IGFBP3、IL-6-IL-4、CAV1-NOS3、VEGFA-NOS3、IL-1β-CCL2，这些蛋白之间的相互作用在网络中非常重要。通过计算每个基因连接节点的数目，找出前10个PPI核心基因，分别为AKT1、IL-6、PPARG、NOS3、MMP9、CCL2、VEGFA、MMP2、SERPINE1、ICAM1，这些即为糖足1号方治疗DF的核心基因。见图2、3。

图2 PPI网络Fig.2 PPI network

图3 PPI核心基因Fig.3 PPI core genes

2.5 GO功能富集分析 GO由生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3部分组成。富集到的BP包括白细胞与细胞黏附的正调控（positive regulation of leukocyte cell-cell adhesion）、脂多糖应答（response to lipopolysaccharide）、白细胞与细胞黏附（leukocyte cellcell adhesion）等。见图4。富集到的CC包括膜筏（membrane raft）、 膜微区（membrane microdomain）、膜区（membrane region）等。见图5。富集到的MF包括细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、整合素蛋白结合（integrin binding）等。 见图6。

图4 糖足1号方主要作用靶点BP条形图Fig.4 The barplot chart of BP of Tangzu No.1 prescription

图5 糖足1号方主要作用靶点CC条形图Fig.5 The barplot chart of CC of Tangzu No.1 prescription

图6 糖足1号方主要作用靶点MF条形图Fig.6 The barplot chart of MF of Tangzu No.1 prescription

2.6 KEGG通路富集分析 对药物-疾病重合靶点进行KEGG通路富集分析，主要富集的通路包括晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体信号通路（advanced glycation end-receptor of advanced glycation end products signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、肿瘤坏死因子信号通路（tumor necrosis factor signaling pathway，TNF signaling pathway）、疟疾（malaria）等。 见图7。

图7 糖足1号方KEGG通路富集分析条形图Fig.7 The barplot chart of KEGG pathway enrichment analysis of Tangzu No.1 prescription

2.7 靶点-通路网络构建 将得到的药物-疾病共同靶点和KEGG通路导入Cytoscape 3.7.2软件，以绘制网络图，以节点间的连线数量确定degree，节点的形状越大表示富集越显著，得到网络中的核心靶点为IL-1β、IL-6、AKT1、FOS、CCL2等。 见图8。

图8 靶点-通路网络Fig.8 Target-pathway network

2.8 分子对接 本研究采用排名前3位的关键化学成分槲皮素（quercetin，MOL000098）、 汉黄芩素（wogonin，MOL000173）、黄芩 素 （baicalein，MOL002714）与PPI核心基因AKT1、IL-6、PPARG分别进行对接。见图9。结果表明，槲皮素、汉黄芩素、黄芩素与AKT1、IL-6、PPARG的结合能均低于-5.0kJ·mol-1，表明这些成分与靶点的结合能力较强，可能是糖足1号方治疗DF的关键化学成分。

图9 结合能最低的关键化学成分-靶点作用模式Fig.9 Interaction between key chemical components-target in lowest docking energy mode

2.9 验证性研究结果 与正常组比较，模型组血清IL-6、IL-1β水平明显升高，创面组织中的PPARG水平明显下降，AKT1水平明显上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组血清IL-6、IL-1β水平显著降低，创面组织PPARG水平明显上升，AKT1水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6、IL-1β和创面组织AKT1、PPARG含量的比较Tab.3 Comparison of serum IL-6，IL-1β and wound tissue AKT1 and PPARG levels in each group

3 讨论

由于糖尿病发病率的逐年增加，DF的发病也有增高趋势，若不能得到及时治疗，DF病情加重会引发患者致残、生活能力丧失的风险，同时给患者带来抑郁情绪，严重者危及生命[13]。中医古籍中虽无DF这一病名，但早在《灵枢·痈疽篇》就有记载：“发于足趾，名曰脱疽，其状赤黑，死不治；不赤黑不死，不衰急斩之，不则死矣。”故将其归属于“脱疽”范畴。糖足1号方重用清热燥湿、泻火解毒之黄芩、黄连、黄柏、苦参，治疗DF临床疗效显著，故本文进一步对其分子机制进行探讨。

本研究发现，糖足1号方所含的槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、脱氢丹参酮ⅡA、吴茱萸次碱等化学成分与靶点基因匹配的自由度较高。槲皮素是一种生物类黄酮，在体内具有消炎和抗氧化保护作用，能够促进人体胶原蛋白和纤连蛋白的生成，促进关节和皮肤创口的愈合，对神经组织损伤亦有修复作用，同时能促进全身毛细血管血液循环；还有研究证实其具有捕获自由基，防止脂质过氧化反应的作用，在抗炎、防治糖尿病并发症方面药理作用较强[14-15]。汉黄芩素具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、免疫调节、神经保护等，此外还具有抗癌和利尿作用[16]。黄芩素具有明显的抗炎、抗菌、解热作用，对于葡萄球菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌等均有明显抑制作用，且对多种皮肤致病性真菌抑制力较强；此外还具有抗变态反应、利尿、抗过敏等作用[17-18]。丹参酮ⅡA能够改善冠状动脉血液循环，常被用于糖尿病血管并发症的防治中；研究发现丹参酮ⅡA还能够清除氧自由基，抑制组胺形成，保护血管内皮[19-20]。吴茱萸次碱能够抑制活性氧产生和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶激活，体现出较强的抗炎作用；有研究发现，吴茱萸次碱能抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等细菌的生长，同时具有保护神经细胞的功能[21-22]。

本研究得到的核心基因包括AKT1、IL-1β、IL-6、PPARG、NOS3、MMP9、CCL2等。AKT1是AKT家族成员之一，调节包括细胞代谢、增殖、存活和血管生成等许多生物学过程，对葡萄糖的摄取具有调节作用[23]。IL-1β是强有力的促炎细胞因子，能诱导前列腺素合成、T细胞活化和细胞因子产生、B细胞活化和抗体产生以及成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生[24]。IL-6是急性期炎症反应的有效诱导剂，在B细胞最终分化为浆细胞的过程中发挥重要调节作用，同时参与淋巴细胞和单核细胞的分化；还能够能起到增加脂肪分解和改善胰岛素抵抗的作用[25]。PPARG能控制脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化途径，是脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键调节器[26]。NOS3属于一氧化氮合酶，能够作用于内皮细胞，参与血管平滑肌松弛、血小板激活、血液凝固的过程[27]。MMP9在细胞外基质的局部水解和白细胞迁移中起着重要作用，还可能参与破骨细胞的吸收[28]。CCL2趋化因子属于内分泌β家族，可以吸引单核细胞和嗜碱性粒细胞，但对中性粒细胞或嗜酸性粒细胞不具有趋化作用[29]。

富集的KEGG信号通路包括AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路等。AGE-RAGE信号通路能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），引起大量黏附分子、促炎细胞因子的表达，导致细胞和组织损伤，与DF的发生发展关系密切[30]。流体剪切应力具有抗血小板聚集的作用，还能刺激抑制凝血级联反应因子的释放[31]。TNF信号通路可促进炎症反应，亦与抑制细胞增殖、抗感染和调节免疫等作用密切相关[32]。与上述信号通路匹配自由度较高的基因为IL-1β、IL-6、AKT1、FOS、CCL2等，可见糖足1号方可通过以上靶点蛋白作用于相关信号通路，发挥抗炎、抗菌、促进组织修复的作用。

进一步进行验证性实验发现，模型组大鼠的血清IL-6、IL-1β水平明显高于正常组，说明IL-6、IL-1β参与了疾病的发生发展；而中药组血清IL-6、IL-1β水平显著低于模型组，提示糖足1号方能显著降低血清IL-6、IL-1β水平，减轻DF大鼠的炎症反应。实验中模型组创面组织的PPARG水平明显降低，AKT1水平明显升高；而中药组创面组织的PPARG水平显著高于模型组，AKT1水平明显低于模型组，提示糖足1号方可通过调节细胞代谢、改善细胞生长和血管生成促进创面愈合。

综上所述，糖足1号方可通过槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、脱氢丹参酮ⅡA等多种有效成分，作用于AKT1、IL-1β、IL-6等多个基因靶点，由AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路等多个信号通路参与的复杂作用机制发挥治疗DF的作用。本研究通过若干数据库信息进行的挖掘分析，对DF的发病机制及用药靶点进行了预测，并进行了小样本的动物实验验证，但验证性实验仅选取了具有代表性的指标，并且未进行临床实验，未来仍需进一步进行动物实验与临床实验进一步探究糖足1号方的作用机制。