基于网络药理学探讨小青龙汤治疗慢性肾小球肾炎的潜在作用机制

郑爽 何丽清 储开博

山西中医药大学 山西，晋中 030619

小青龙汤是《伤寒论》中治疗外寒里饮的经典方剂，临床多用于治疗肺系疾病[1]。除此之外，小青龙汤在临床上也可治疗与肺、脾、肾三脏相关的水液代谢疾病，例如痰饮、水肿、泄泻等[2]，也有医家运用小青龙汤治疗慢性肾脏疾病的相关案例[3-4]。

慢性肾小球肾炎（chronic glomerulonephritis，CGN），简称慢性肾炎，是临床常见的慢性肾脏病，以蛋白尿、血尿、水肿等为基本症状[5]，具有起病隐匿、病程迁延的特点，现代医学尚无有效方法根治。CGN在中医没有专门的病名，根据临床症状的不同，可将其归为“尿血”“水肿”“痰饮”等范畴，中药治疗历史悠久，而且效果显著。

网络药理学这一概念由英国药理学家Andrew于2007年提出，是基于系统生物学理论，通过网络分析技术分析药物、基因、疾病之间的复杂关系。在临床上面对复杂疾病时，从网络生物学角度审视药物的作用能够为寻找治疗方法提供新的视角[6]。

通过文献查阅，笔者了解到目前对于小青龙汤的研究多集中于肺系疾病，有少部分文献报道小青龙汤对CGN具有治疗作用，但相关的临床以及实验研究均较少，其药理作用与作用机制尚未明确。本文旨在通过网络药理学分析，从分子水平上阐明小青龙汤的化合物成分靶点与CGN的疾病靶点之间的潜在关系，预测小青龙汤治疗CGN的潜在作用靶点，为进一步深入研究小青龙汤治疗CGN的作用机制提供理论基础。

1 对象和方法

1.1 小青龙汤化学成分与靶点的收集 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） （https://tcmspw.com/tcmsp.php），分别以“麻黄、桂枝、芍药、干姜、细辛、半夏、五味子、甘草”为关键词，检索小青龙汤组方中药物的化学成分。以药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18为筛选条件进行筛选，得到小青龙汤的候选化合物以及这些成分所作用的靶点，重复靶点仅保留1个。

1.2 小青龙汤治疗CGN的潜在靶点的获取 以“chronic glomerulonephritis”为检索词，分别从在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库、基因组注释数据平台（genome annotation database platform，Genecard）中搜索已报道的CGN的相关基因，去除重复基因和假阳性基因，将收集到的基因与上述成分靶点上传至韦恩图2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行匹配分析，得到小青龙汤治疗CGN相关的潜在作用靶点。

1.3 预测潜在核心成分以及核心靶点 将小青龙汤治疗CGN的潜在作用成分与靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建“化合物-靶点”网络图。通过软件分析节点自由度（Degree），对各节点进行拓扑分析，筛选出小青龙汤治疗CGN的核心成分与核心靶点。

1.4 蛋白质相互作用（protein protein interaction，PPI）网络图的构建 将小青龙汤的核心作用靶点上传至String 11.0平台（https://string-db.org）得到核心靶点的PPI网络，并构建PPI网络图。

1.5 潜在作用靶点的通路富集分析 将小青龙汤治疗CGN的潜在作用靶点上传至生物学信息注释数据库DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，GO分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。 以P＜0.01为筛选条件筛选GO条目，以P＜0.05为条件筛选KEGG条目，最后将GO和KEGG富集分析结果进行可视化。

2 结果

2.1 小青龙汤药物化合物和靶点的筛选 在TCMSP中检索小青龙汤中8味中药的化合物及其对应的作用靶点，得到1 534种化合物，以OB≥30%、DL≥0.18筛选后去掉重复化学成分，得到小青龙汤的有效化合物149种，作用靶点288个。

2.2 小青龙汤治疗CGN潜在靶点的获取 通过数据库检索，得到CGN相关基因共有2 425个。通过与小青龙汤的288个作用靶点进行比对，筛选出154个可能与治疗CGN相关的作用靶点。见图1。

图1 小青龙汤与CGN靶点的韦恩图Fig.1 Venn diagram of Xiaoqinglong Decoction and CGN

2.3 预测潜在核心成分以及核心靶点 通过Cytoscape 3.7.2软件构建“化合物-靶点”网络。见图2。图中菱形节点代表小青龙汤治疗CGN的核心化合物，圆形节点代表小青龙汤治疗CGN的核心靶点，颜色深浅表示Degree大小，颜色越深则Degree值越大。以化合物和靶点为节点（Node），相互关系为边（Edge），利用软件分析各个节点的自由度（Degree）进行网络拓扑分析，预测小青龙汤治疗CGN的核心成分与核心靶点，共筛选出40个潜在核心成分和40个潜在核心靶点。部分信息见表1。

表1 部分小青龙汤治疗CGN核心化合物及其所对应的核心靶点Tab.1 Some core components and related targets of Xiaoqinglong Decoction Treating CGN

图2 小青龙汤治疗CGN的“化合物-靶点”网络图Fig.2 The component-target network diagram of Xiaoqinglong Decoction and CGN

2.4 PPI网络图的构建 将小青龙汤治疗CGN的核心靶点导入String 11.0平台，在线构建PPI网络图。见图3。网络中有40个节点发生相互作用，相互作用的边有155条，平均自由度（Degree）为7.75。

图3 PPI网络图Fig.3 PPI network diagram

2.5 潜在靶点的GO、KEGG富集分析 将小青龙汤治疗CGN的潜在核心靶点导入生物学信息注释数据库DAVID 6.7在线进行GO富集分析，共获得GO条目279条，其中BP 275条、CC 31条、MF 46条。 以P＜0.01为条件进行筛选，对前10项进行可视化。见图4。小青龙汤治疗CGN涉及血管生成、血管内皮细胞迁移的正调控、脂多糖介导的信号通路、类固醇激素受体活性、细胞外调节蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinases 1，ERK1）和ERK2级联的正调控等过程。

图4 GO功能分析可视化结果Fig.4 Visualization result of GO

将小青龙汤治疗CGN的潜在核心靶点导入DAVID 6.7进行KEGG通路富集分析，得到KEGG通路条目89条，以P＜0.05为条件，对前25条通路进行可视化分析。见图5。KEGG通路富集分析结果中包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶 B （phosphatidylinositide 3-kinases-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路和Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）信号通路等，说明小青龙汤治疗CGN的机制可能与调节这些信号通路相关。

图5 KEGG通路富集分析可视化结果Fig.5 Visualization result of KEGG pathway

3 讨论

中医认为CGN的病位主要在肺脾肾三脏。脾主运化，脾气亏虚，则不能运化水湿；肾主水，肾气亏虚，则不能气化水湿、宣通水气。根据五行生克的原理，肺属金能生水，为肾水之母，子病治母是中医的治法之一；且肺主气行治节，明代张介宾[7]认为，水肿“盖水为至阴，故其本在肾；水化于气，故其标在肺”。肺主宣发肃降，能够肃降水液，下输至肾与膀胱，肺失宣降导致气机不调，精微不升，出现蛋白尿和尿血等症状。CGN在中医属“尿血”“水肿”“痰饮”等范畴，《金匮要略》中提出“痰饮”“水肿”可通过发汗、利尿等方法治疗。小青龙汤主治外寒里饮证，以麻黄、桂枝为君，发

汗散寒解表、温阳化气，以化肾水；细辛、干姜为臣，助麻桂解表的同时亦能温肾行水；白芍五味子味酸收敛，以免辛散肺气太过，亦为臣；半夏为使，降气散水饮；甘草为佐使，益气和中、调和诸药。故CGN辨证外寒里饮兼有水肿时，可用小青龙汤治疗。从现代医学角度分析，CGN合并感染，诱发机体免疫反应，日久造成肾损伤，引发或加重CGN[8]。根据文献报道，小青龙汤治疗CGN寒饮蕴肺证大鼠，能够降低大鼠尿蛋白水平，保护肾功能，防止肾组织病理变化，故小青龙汤治疗CGN有充足的理论依据[9]。

网络药理学是一种通过综合分析和筛选各种基因、蛋白、药物数据库，利用网络分析软件构建“化合物-靶点-疾病”网络，系统揭示三者之间关联的药理研究方法[10]。中药治疗CGN所具有的整体性、多靶点、多通路的特点，适合应用网络药理学方法进行研究，因此本研究基于网络药理学，探讨了小青龙汤治疗CGN的潜在作用机制。

本研究通过构建“化合物-靶点”网络图，找到了小青龙汤治疗CGN的潜在核心化合物，这些化合物均能作用于多个靶点，包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、 豆甾醇 （stigmasterol）、β-谷甾醇 （βsitosterol）、柚皮素（naringenin）、木犀草素（luteolin）、黄芩苷（baicalein）、卡维丁（Cavidine）、隐品碱（cryptopin）、花旗松素（taxifolin）等。其中β-谷甾醇为麻黄、桂枝、白芍、干姜、半夏的活性成分，山奈酚在麻黄、白芍、细辛、甘草中均有分布，豆甾醇在麻黄、半夏中分布，儿茶素在麻黄、桂枝、白芍中分布，花旗松素为麻黄、桂枝的活性成分，可以看出君药麻黄、桂枝中含有多种相同的化合物，由此笔者认为麻黄、桂枝解表散寒、温化阳气的功效可能与这些化合物有关。槲皮素是一种黄酮醇类化合物，其作用机制可能是通过抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化激活过程，进而抑制其下游蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，AKT/mTOR）通路的信号传导，同时抑制该通路下游的增殖相关基因VEGF[11]。实验研究表明，槲皮素能够减轻高糖条件下人肾小球内皮细胞的损伤[12]，也能够减轻放射性对比剂引起的肾损伤，起到保护肾脏的作用[13]。山奈酚也被证实能够抑制人肾小球内皮细胞氧化应激和凋亡[14]。β-谷甾醇可能通过诱导转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 失活，从而发挥抗炎作用[15]。柚皮素则通过抑制半胱天冬酶-3（caspase-3，CASP3）等凋亡相关蛋白的表达，抑制肾小球系膜细胞凋亡[16]。木犀草素能够减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾脏的炎症反应，改善肾功能[17]。黄芩苷可能通过调控TLR2/4信号通路和线粒体应激，抑制促炎反应和线粒体介导的细胞凋亡，从而减轻肾脏缺血再灌注造成的损伤[18]。综合分析提示，小青龙汤通过各组成药物之间的协同作用，多靶点而并非单一靶点治疗CGN，其核心成分能够通过调节相关通路，从而减轻肾脏炎症反应，抑制内皮细胞氧化应激和细胞凋亡，缓解肾损伤。

通过分析PPI网络以及“化合物-靶点”网络图，进一步确定了40个核心靶点，包括前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、CASP3、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogenactivated protein kinase 14，MAPK14）。 PTGS2也被称为环氧合酶2（cyclooxygenase，COX-2）。 研究证实，COX-2是前列腺素合成的关键诱导酶，参与炎症反应、血管紧张度维持、电解质平衡和肾素释放过程，且与蛋白尿诱导的足细胞损伤有关[19]。Yang等[20]研究证实，CASP3能够对肾纤维化以及微血管内皮细胞凋亡起到调节作用。肾小球系膜细胞的增殖失控是肾脏疾病的共同特征，ESR1作为枢纽蛋白在肾小球膜细胞增殖中具有重要作用，目前被认为是肾脏疾病的潜在靶标之一[21]。AR在许多细胞和组织中广泛表达，研究表明AR可能通过调节血管内皮生长因子/缺氧诱导转录因子-2α（vascular endothelial growth factor/hypoxia-inducible transcription factor-2α，VEGF/HIF-2α）信号通路的信号传导来促进肾癌细胞迁移[22]。MAPK14参与多种信号通路的过程，与细胞增殖分化以及炎症反应密切相关。研究表明，MAPK14在肾小管细胞炎症和增殖反应的调节中具有重要作用，通过促进炎症和细胞死亡，导致急性肾损伤[23]。

GO及KEGG富集分析结果显示，小青龙汤治疗CGN主要涉及血管生成、血管内皮细胞迁移的正调控、脂多糖介导的信号通路、类固醇激素受体活性、细胞外调节蛋白激酶的正调控等过程，参与调控的信号通路包括VEGF信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路和TLR信号通路，表明小青龙汤的多种活性化合物通过参与调控多种信号通路，协同发挥疗效。VEGF信号通路通过抑制足细胞中VEGF和Nephrin蛋白的表达，造成蛋白尿[24]。抑制HIF-1信号通路能够改善肾间质纤维化大鼠肾功能，缓解肾组织肾小球硬化[25]。TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路则能够通过调节细胞周期，抑制细胞凋亡和炎症反应[26]。

综上所述，本次研究基于网络药理学网络化、可视化的特征，初步研究小青龙汤治疗CGN潜在的作用机制，找到了其治疗机制中的核心化合物与核心靶点，分析了相关生物过程和信号通路，但网络药理学是基于数据库的综合分析和筛选，并未进行实际的实验研究，故本研究的结论仍需要进一步的体外和体内研究加以证明。