AFB1对犬肝细胞的毒性作用及NAC的保护效应

张 咪，赵 杰，徐静茹，曹 利，冯士彬，李 玉，阮崇美，辜丽川，吴金节，王希春

(1 安徽农业大学 a动物科技学院 b信息与计算机学院，安徽 合肥 230036；2 安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

霉菌毒素(mycotoxin)是指由霉菌在特定环境下产生的一类毒性次生代谢产物，能够消耗饲料中的营养成分，降低其品质并散发出特殊的“霉臭”气味，导致动物采食量降低、机体免疫机能与生产性能下降等[1]。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一类带有香豆素和双呋喃环的毒性代谢产物，具有致癌、致畸、致突变作用[2]。黄曲霉毒素的衍生物约有20余种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，致癌性最强[3]。AFB1能够对人和动物的健康产生不同程度的损害，肝脏是AFB1的主要靶器官。研究表明，给动物饲喂含有AFB1的日粮，AFB1对动物体质重增长具有显著的抑制作用，肝脏的形态和脏体比发生了明显变化，且肝脏出现出血、部分坏死、变色等病理现象[4-6]。同时，AFB1可严重影响动物体的肝功能，其中氧化和抗氧化标志性酶类或非酶类分子呈现显著性增加或减少[7]。目前，关于AFB1对肝细胞毒性作用的报道仅限于雏鸡、雏鸭、锦鲤等动物[8-10]，关于AFB1对犬原代肝细胞的毒性研究尚未见报道。

N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，简称乙酰半胱氨酸，是氨基酸L-半胱氨酸的N-乙酰衍生物。NAC含有的巯基具有抗氧化作用，能够减少自由基的产生[11]。同时NAC也是半胱氨酸的供体，半胱氨酸是谷胱甘肽形成时的必需氨基酸，因此NAC还能够维持动物体内抗氧化物谷胱甘肽水平[12-13]。有研究表明，NAC对肝脏具有保护作用，可调节大鼠肝细胞凋亡基因[14-15]。薛画眉等[16]研究了NAC对玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞毒性的保护作用，但未见NAC对AFB1毒性缓解作用的报道。针对以上研究现状，本试验以犬原代肝细胞为模型，研究AFB1对肝细胞的毒性作用以及NAC的保护效应，以期为AFB1毒性的有效防控提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验动物 选择1～2月龄比格犬幼犬，试验前，常规饲养1周，进行临床检查，确保机体健康。

1.1.2 材料与仪器 N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，购于北京索莱宝公司；黄曲霉毒素B1(AFB1)，购于美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，购于美国Hyclone公司；RNAiso Plus，购于大连宝生物工程公司；CCK-8试剂盒，购于合肥赛国生物科技公司；Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit试剂盒，购于美国BD(Becton Dickinson)公司；TRIZOL RNA提取试剂盒，购于美国Thermo Fisher 公司(Invitrogen)；丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷酸(8-HdG)、过氧化氢(H2O2)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于江苏酶标公司。CX31型生物显微镜，购于日本Olympus公司；CO2恒温培养箱，购于美国Thermo公司；FACSCalibar流式细胞分析仪，购于美国BD公司；核酸浓度测定仪，购于美国Thermo Fisher公司；荧光实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪，购于美国ABI公司；电泳仪、凝胶成像仪，购于上海伯乐生命医学产品公司；肝功能试剂盒与全自动血液生化分析仪，购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.2 犬原代肝细胞的分离与培养

对1～2月龄幼犬前肢静脉注射肝素钠，用5 mg/kg舒泰麻醉后，固定于手术台，剃毛消毒后，无菌条件下取出肝脏，移至无菌超净台内，采用胶原酶法[17]处理肝脏直至流出澄清液体，终止消化。将肝脏剪切成泥状，充分与RPMI-1640培养基混合，剔除多余的组织，过滤后收集原代肝细胞，取少量细胞悬浊液，洗涤3次。将分离的原代肝细胞按照2×106mL-1接种细胞培养板，培养4 h后吸出上清液或死亡的未贴壁细胞，更换RPMI-1640培养基，继续培养24 h，保证细胞健康状态良好。重复上述步骤更换RPMI-1640培养基，继续培养24 h，此时共培养48 h，原代肝细胞达到对数生长期[18]。

1.3 AFB1最佳处理时间和质量浓度及NAC最佳保护浓度的筛选

取1.2中对数生长期的犬原代肝细胞，用0(对照)，0.05，0.25，1.25，6.25，31.25 μg/mL AFB1分别培养24，36，48 h，每处理3个平行试验，用CCK-8试剂盒检测细胞活性，分析AFB1的最佳处理时间，并筛选AFB1的最佳攻毒质量浓度。

取1.2中对数生长期的犬原代肝细胞，分别用0(对照)，0.1，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0，128.0，256.0，512.0 mmol/L NAC培养36 h，每处理3个平行试验，用CCK-8试剂盒检测细胞活性，筛选出保护剂NAC的最佳作用浓度。

1.4 细胞生长状态和超微结构的观察

选择对数生长期的犬原代肝细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞密度为1×105mL-1，培养至贴壁后更换培养液，分别用0，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理后培养36 h，在倒置光学显微镜下观察各试验组细胞的形态。

选择对数生长期的犬原代肝细胞，将细胞分别用0，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理后培养36 h，用PBS溶液吹落细胞培养板中的细胞，1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，收集细胞，将其与体积分数2.5%戊二醛混合后静置于4 ℃冰箱24 h，用PBS漂洗后用体积分数1%锇酸进行后固定，PBS漂洗，丙酮梯度脱水，梯度渗透，包埋，切片，最后正染，用透射电子显微镜观察犬原代肝细胞超微结构。

1.5 肝功能相关指标的检测

试验分为对照组(0 μg/mLAFB1)、不同质量浓度(0.05，0.25，1.25，6.25，31.25 μg/mL)AFB1处理组和NAC保护组(6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC)，在各处理组中分别加入犬原代肝细胞，培养36 h至对数生长期，取上清液于1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，取上清液，每组设3个平行，采用全自动血液生化分析仪检测碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性以及总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)的质量浓度。

1.6 氧化与抗氧化功能的测定

取1.5中离心后的各处理组的细胞上清液，按照各试剂盒说明书步骤操作，测定8-OhdG、MDA、H2O2含量以及GSH-Px、CAT和SOD活性。

1.7 细胞凋亡率的检测

取1.5中对照组(0 μg/mL AFB1)、6.25 μg/mL AFB1处理组和6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理组的细胞，将其在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养36 h 后，在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率[19]。

1.8 凋亡基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA相对表达量的测定

取对数生长期的犬原代肝细胞，用0(对照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理36 h后，倾斜吸出细胞板中的上清液，加入4 ℃的PBS缓冲液处理后，弃上清液，加入1 mL RNAiso Plus，提取RNA，用核酸浓度测定仪检测总RNA的浓度，可知各处理组的RNA品质符合试验要求。采用逆转录试剂盒superscript Ⅲ，按照说明书建立逆转录反应体系，分别将各处理组的RNA逆转录合成cDNA，将其置于-20 ℃保存。参考GenBank数据库，设计合成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解激活酶3基因 (cleaved-caspase-3)、天冬氨酸蛋白水解激活酶9基因(cleaved-caspase-9)引物。选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)为内参基因，设计其引物。试验引物序列如表1所示。

表1 供试的荧光实时定量PCR引物序列Table 1 Sequences for primers for quantitative real-time PCR

采用荧光实时定量PCR扩增各试验组的cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9基因和内参基因GAPDH，PCR反应体系为：qPCR反应混合物10 μL，2.5 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性120 s；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 30 s，40个循环。每个处理3个重复。PCR反应结束后，收集循环阈值(Ct),利用2-ΔΔCt法计算cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9基因的相对表达量。

1.9 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 AFB1对犬原代肝细胞毒性的最佳作用时间及攻毒质量浓度

不同质量浓度AFB1对犬原代肝细胞活性的影响如图1所示。由图1可知，随着AFB1质量浓度的增加，处理36 h细胞的存活率总体呈降低的趋势，呈现浓度依赖性；而处理24和48 h的犬原代肝细胞则无明显变化规律，因此在后续的试验过程中均选择36 h作为AFB1处理犬原代肝细胞的最佳时间。

不同质量浓度AFB1处理36 h对犬原代肝细胞活性的影响结果(图1)显示，随着AFB1质量浓度的增加，犬原代肝细胞活性呈降低的趋势，且当AFB1质量浓度为6.25 μg/mL时，犬原代肝细胞活性降至最低；之后随着AFB1质量浓度的继续增加，犬原代肝细胞活性无显著变化，故后续试验选择6.25 μg/mL作为AFB1处理犬原代肝细胞的最佳质量浓度。

**表示不同质量浓度AFB1处理36 h后与对照组(0 μg/mL AFB1)差异达极显著水平(P<0.01) **means extremely significant differences between AFB1 treatments for 36 h and the control group(0 μg/mL AFB1)(P<0.01)图1 不同质量浓度AFB1对犬原代肝细胞活性的影响Fig.1 Effects of different concentrations of AFB1 on cell activity of canine primary hepatocytes

2.2 NAC对犬原代肝细胞活性最佳保护浓度

图2为不同浓度NAC对犬原代肝细胞活性的影响结果。由图2可知，随着NAC浓度的增加，细胞活性呈先降低后增加再降低的趋势，当NAC浓度为64.0 mmol/L时，细胞活性达到最高；之后随着NAC浓度的增加，细胞活性逐渐降低。故64.0 mmol/L为NAC对犬原代肝细胞的最佳保护浓度。

图2 不同浓度NAC对犬原代肝细胞活性的影响Fig.2 Effect of NAC concentration on cell activity of canine primary hepatocytes

2.3 AFB1和NAC处理后犬原代肝细胞生长状态的光学显微观察

AFB1和NAC处理后犬原代肝细胞生长状态的光学显微观察见图3。如图3所示，0 μg/mL AFB1处理细胞贴壁情况好，细胞间连接紧密；0.05～6.25 μg/mL AFB1处理的细胞发生了明显变化，且随着AFB1质量浓度的增加，细胞数量逐步递减，细胞间隙变大，视野中破碎细胞、漂浮细胞逐渐增多，细胞失去饱满性，出现凋亡、坏死的现象逐渐明显且愈加严重。与6.25 μg/mL AFB1处理细胞相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理细胞饱满且活性良好，细胞数目增加，视野中漂浮的裂解细胞碎片较少。

2.4 AFB1和NAC处理后犬原代肝细胞超微结构的电子显微观察

观察发现，对照组中，肝细胞的细胞膜完整，且具有肝细胞伪足现象，细胞胞核形态完整且规则，染色质在胞核内分布均匀，各类细胞器在细胞内形态未见明显异常(图4-A)。0.05～6.25 μg/mL AFB1处理的肝细胞中，细胞核的核膜开始皱缩，染色质凝集并出现不同程度的边移化，细胞内的细胞器也发生相应变化，细胞器出现空泡化现象，线粒体的体积增大，并且细胞凋亡情况会随AFB1质量浓度的递增而越发明显，同时凋亡小体的数量逐渐增加(图4-B～E)。6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理的肝细胞状态良好，结构完整(图4-F)。

A～F表示0(对照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理36 h的犬原代肝细胞A-F represent logarithmic phase of cell in the 0(control),0.05,0.25,1.25,6.25 μg/mL AFB1 and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC treatments for 36 h图3 AFB1和NAC处理后犬原代肝细胞的形态学比较(400×)Fig.3 Morphological characteristics of canine primary hepatocytes treated with AFB1 and NAC (400×)

A～F表示0(对照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理36 h犬原代肝细胞。→表示细胞出现空泡化；▲表示线粒体肿胀；Δ表示细胞膜破裂；◆表示染色质边移化A-F represent 0(contrast),0.05,0.25,1.25, 6.25 μg/mL AFB1 and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC treatment for 36 h. → indicates vacuolization of cells;▲ indicates mitochondrial swelling;Δ indicates membrane rupture;◆ indicates chromatin edging

2.5 AFB1对犬原代肝细胞肝功能指标的影响

由表2可知，与对照组(0 μg/mL AFB1)相比，当AFB1质量浓度高于1.25 μg/mL时，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性随着AFB1质量浓度的增加显著上升(P<0.05)；经0.05～31.25 μg/mL AFB1处理后碱性磷酸酶(ALP)活性显著升高(P<0.05)。与对照组相比，当AFB1质量浓度高于1.25 μg/mL时，γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)活性显著降低(P<0.05)；当AFB1质量浓度为0.05～0.25 μg/mL时，γ-GGT活性显著增加(P<0.05)。与对照组相比，当AFB1质量浓度为31.25 μg/mL时，ALB质量浓度显著降低(P<0.05)；用0.05～31.25 μg/mL AFB1处理后，TP质量浓度无显著变化。与6.25 μg/mL AFB1组相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组AST、ALP、γ-GGT活性和TP、ALB质量浓度显著降低(P<0.05)。

表2 AFB1对犬原代肝细胞肝功能指标的影响Table 2 Effect of AFB1 on liver function of canine primary hepatocytes

2.6 AFB1对犬原代肝细胞氧化与抗氧化指标的影响

由表3可知，与对照组(0 μg/mL AFB1)相比，不同质量浓度AFB1处理组的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和丙二醇(MDA)含量显著增加(P<0.05)。较高质量浓度(1.25～31.25 μg/mL)AFB1处理后，H2O2质量浓度显著增加(P<0.05)，且随着AFB1质量浓度的增加，H2O2质量浓度呈上升趋势。6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组的8-OHdG、MDA和H2O2表达水平与6.25 μg/mL AFB1组相比显著降低(P<0.05)。与对照组相比，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性随着AFB1质量浓度的增加均无显著变化；当AFB1的浓度为0.25～31.25 μg/mL时，过氧化氢酶(CAT)活性显著降低(P<0.05)。6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组CAT和GSH-Px活性与6.25 μg/ml AFB1组相比显著升高(P<0.05)，而SOD活性无显著变化。

表3 AFB1和NAC对犬原代肝细胞氧化与抗氧化指标的影响Table 3 Effects of AFB1 and NAC on oxidant and antioxidant indexes in hepatocytes

2.7 AFB1对犬原代肝细胞凋亡的影响

检测结果显示，6.25 μg/mL AFB1组的细胞凋亡率最高，达到12%，与对照组(4%)相比极显著增加(P<0.01)；6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组的细胞凋亡率(7%)虽极显著高于对照组(P<0.01)，但与AFB1组相比极显著降低(P<0.01)。

2.8 AFB1对犬原代肝细胞凋亡相关基因表达的影响

如图5所示，与对照组相比，随着AFB1质量浓度的增加，cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA的相对表达量极显著增加(P<0.01)。与6.25 μg/mL AFB1组相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA相对表达量均极显著降低(P<0.01)。

A～F表示用0(对照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理犬原代肝细胞，**代表0.05～6.25 μg/mL AFB1处理组和6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理组与对照组(0 μg/mL AFB1)差异极显著(P<0.01)，##代表6.25 μg/mL AFB1处理组与6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理组差异极显著(P<0.01)A-F represent canine primary hepatocytes treated with 0(control group),0.05,0.25,1.25,6.25 μg/mL AFB1 and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC，** means extremely significant difference in 0.05-6.25 μg/mL AFB1 groups and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC groups in comparison with the control group (0 μg/mL AFB1) (P<0.01)，## means extremely significant difference between the 6.25 μg/mL AFB1 group and the 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NACd group (P<0.01)图5 AFB1对犬原代肝细胞凋亡相关基因相对表达量的影响Fig.5 Effect of AFB1 on relative expression of apoptosis related genes in canine primary hepatocytes

3 讨 论

AFB1的毒性机制是通过激活CYP450产生代谢物，从而影响细胞的正常代谢和蛋白质合成等[20]。本研究中，当用0～6.25 μg/mL AFB1处理36 h后，随AFB1质量浓度的增加，犬原代肝细胞活性逐渐降低，说明在一定浓度范围内，犬的原代肝细胞对AFB1具有浓度依赖性，这与Ribeiro等[21]的研究结果相似。刘珊等[22]用AFB1对人皮肤成纤维细胞(HSF)进行攻毒时，选择的时间为15 d，说明AFB1的毒性作用受年龄、物种、器官、组织、细胞种类的影响。本研究观察发现，当用0.05～6.25 μg/mL AFB1处理后，犬原代肝细胞数目随着AFB1质量浓度的增加而逐渐减少，细胞膜变薄，细胞之间的衔接距离增大，细胞的生长状态逐渐变差，细胞发生裂解、死亡的现象，并具有浓度依赖性。梁娜等[23]通过观察雏鸡胸腺H.E.染色的病理切片后发现，受AFB1污染的胸腺中有大量的细胞核碎片，本研究结果与其基本一致。

细胞死亡类型分坏死和凋亡。本研究通过电子显微观察发现，对照组犬原代肝细胞的细胞膜完整，细胞核饱满，细胞器形态正常；随着AFB1质量浓度的增加，细胞凋亡情况逐渐严重，细胞膜破损，细胞核出现不同程度的皱缩、碎裂，染色质凝集或边移，细胞器出现空泡状，凋亡小体出现。细胞凋亡本是一种正常的生命活动，但凋亡过度会引起组织萎缩。Saifei等[24]和Heil等[25]研究显示，NAC单独作用不会诱导细胞发生凋亡。本研究中，6.25 μg/mL AFB1处理犬原代肝细胞凋亡率为12%，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC处理组细胞凋亡率为7%，可知NAC可保护5%左右的细胞免遭凋亡，表明NAC具有抑制细胞凋亡的作用，这与前人的研究结果[26]相同。

细胞的凋亡途径包括2种，即细胞外途径和细胞内途径，其中蛋白酶Caspases在凋亡通路中起着至关重要的作用[27]，其可分为具有启动能力的caspase-2、caspase-8、caspase-9和起效应功能的caspase-3、caspase-6、caspase-7，这些因子被蛋白水解激活后，便开始启动细胞死亡程序[28]。本试验中，当AFB1质量浓度为0～6.25 μg/mL时，随着AFB1质量浓度的增加，细胞内的凋亡基因cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9 mRNA表达量总体呈剂量依赖性增大；与6.25 μg/mL AFB1组相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组的凋亡基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表达量极显著降低，说明NAC能降低AFB1激活的凋亡基因的表达。

NAC在细胞上的应用主要是由于它具有抗氧化性以及能够抑制细胞的凋亡。细胞发生氧化损伤的原因是细胞内的活性氧过量引起氧化应激反应[29]，使细胞中的细胞器受损。在细胞中常见的抗氧化物酶有GSH-Px、MDA、SOD、硫化物等，有研究发现，当细胞损伤时最重要的抗氧化物是谷胱甘肽[30]。谷胱甘肽的形成需要3种必需氨基酸，其中半胱氨酸便是限制谷胱甘肽合成的最后一种氨基酸[31]，而NAC是半胱氨酸的供体，可以维持谷胱甘肽的水平[32]。因为NAC具有毒性作用比较小、水溶性好且在自然条件下不易氧化等特性，在临床上当谷胱甘肽缺失时，可以选择NAC直接用药[32]。除作为抗氧化物前体物质的功能外，人们还发现NAC自身也有清除细胞内氧自由基的作用[32]。本试验结果表明，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC组的细胞生长状态良好，结构完整，细胞器正常；与6.25 μg/mL AFB1组相比，其细胞凋亡率极显著降低，cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表达量也极显著降低，8-OHdG、MDA和H2O2水平均显著降低，GSH-Px和CAT活性均显著增加。由此可知，NAC能够显著提高犬原代肝细胞抗氧化酶活性，降低肝细胞的损伤和凋亡水平，缓解AFB1对犬原代肝细胞的损伤，具有一定的保护性，与预期相符合。

综上所述，AFB1能够引起犬的原代肝细胞形态异常，且具有明显的浓度依赖性细胞毒性作用；AFB1能够影响肝细胞内ALT、AST、ALP、γ-GGT活性，造成肝细胞损伤及肝功能异常；同时AFB1能激活细胞内促凋亡基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA的表达，加快肝细胞凋亡；而NAC能够显著降低AFB1对犬原代肝细胞的损伤和凋亡，维持肝功能相关指标的正常水平，通过提高GSH-Px和CAT活性，发挥抗氧化作用，降低细胞内氧化水平和凋亡基因的表达，进一步缓解AFB1对肝脏的损伤。