牛优势卵泡颗粒细胞与膜细胞中生殖激素合成相关基因的筛选与分析

赵园园，吴震洋，安清明，孟金柱

(铜仁学院，贵州 铜仁 554300)

雌性哺乳动物的卵泡是生殖系统的重要组成部分，它包含卵母细胞、颗粒细胞(GCs)和膜细胞(TCs)[1]。TCs位于卵泡外部，能够接收外来信号并在细胞色素P450 17A1(CYP17A1)的作用下产生雄激素[2]；而GCs位于卵泡内部，通过细胞色素P450 19A1 (CYP19A1)将雄激素转化为雌激素[3]。GCs和TCs协同合成类固醇激素并分泌到胞外，通过信号转导控制卵母细胞的发育和成熟，进而影响卵母细胞的排出[4]。在不同生理条件下，GCs和TCs之间存在着复杂的信号网络以调节雄激素的合成分泌[5]，关于GCs调控TCs中类固醇激素的研究比较分散，调控机制尚不清楚。

Edson等[6]研究了牛、羊及人类卵泡中GCs和TCs的生理作用，发现不同物种之间GCs和TCs的生理作用存在差异性。Hatzirodos等[7]通过对牛直径为3～5 mm及直径大于9 mm卵泡的GCs和TCs进行转录组测序，发现了许多细胞外基质基因，其中线粒体定位富含谷氨酸蛋白(MGARP)、甘氨酸脱羧酶(GLDC)、碳水化合物磺基转移酶8(CHST8)、谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)是颗粒细胞新的潜在标记物，而腓骨蛋白5(FBLN5)、骨甘氨酸(OGN)、受体活性修饰蛋白2(RAMP2)在TCs的表达水平显著高于GCs。Bonnet等[8]采用激光捕获显微切割技术(LCM)和芯片，分析识别绵羊早期卵泡发育过程中卵母细胞与GCs的基因表达模式，阐明了不同类型细胞的mRNA库在原始卵泡向中间卵泡过渡的过程中受到动态调控。

目前关于牛优势卵泡GCs和TCs中生殖激素合成及分泌机制的研究尚未见报道，为此，本研究对GEO数据库GSE83524 RNA-seq表达谱中GCs和TCs之间的差异表达基因进行了筛选及生物信息学分析，并通过Real-time PCR对相关基因的表达情况进行了验证，以期为探明牛优势卵泡中GCs和TCs在生殖激素合成及分泌过程中的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

从贵州省铜仁市万山区肉牛屠宰场选取10头健康的青年(1岁龄)母思南黄牛，屠宰后采集卵巢上的最大(直径8 10 mm)卵泡(每头牛1枚)，迅速置于4 ℃灭菌杜氏磷酸缓冲液(DPBS)中并运回实验室，参考文献[9]的方法筛选优势卵泡，最终获得5个样本。

将筛选出的优势卵泡放到盛有生理盐水的培养皿上，使用眼科剪刀将卵泡剪开，分别用细胞刮刀刮取位于卵泡壁上的GCs和TCs，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 差异表达基因筛选

1.2.1 芯片数据 在美国国立生物信息中心GEO数据库(http：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中搜索“bovine follicle development”，获得GSE83524 RNA-seq表达谱，其中纳入了4头牛优势卵泡中的GCs样本和3头牛优势卵泡中的 TCs样本。

1.2.2 差异表达基因的筛选与GO和KEGG分析 使用在线软件GEO2R(https://www.ncbi.nlon.nih.gov/geo/geo2r1)对牛优势卵泡中GCs和TCs之间的差异表达基因进行筛选，筛选条件为：|差异倍数lb值 |≥1.5，每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数(FPKM)≥2，校正后的P<0.01。

使用DAVID软件对获得的差异表达基因进行GO(gene ontology)功能富集分析；为了获得与细胞内生殖激素合成相关的信号通路，使用KOBAS软件进行KEGG(kgoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路分析，筛选出GCs和TCs之间参与生殖激素合成相关信号通路。

使用String软件构建蛋白与蛋白之间的相互作用网络(PPI)，并将得到的互作数据导入Cytoscape软件，通过其Cyto-Hubba插件的MCC算法筛选出排名前10位的Hub基因。

1.3 差异表达基因验证

1.3.1 总RNA提取与反转录 从-80 ℃冰箱中取出3个样本的GCs和TCs置于冰盒上解冻，用Trizol法分别提取2种细胞的总RNA，采用NanoDrop 2000测量浓度。用北京全式金生物技术有限公司EasyScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix将总RNA反转录为cDNA，备用。

1.3.2 引物的设计与合成 以核糖体磷酸化蛋白大亚基P0基因(RPLP0)为内参基因，选取参与卵巢类固醇激素生成的腺苷酸环化酶3基因(ADCY3)、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、腺苷酸环化酶8基因(ADCY8)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白基因(GNAS)、骨形态发生蛋白6基因(BMP6)5个差异表达基因进行验证。

用Primer 5.0设计ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6及内参基因RPLP0引物，引物序列及扩增产物长度如表1所示，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 试验所用引物信息Table 1 Sequences of tested primers

1.3.3 Real-time PCR验证 根据北京全式金生物技术有限公司TransStart®Tip Green qPCR SuperMix使用说明，建立20 μL Real-time PCR反应体系：模板cDNA 4 μL，上、下游引物各0.5 μL， SYBR MIX 10 μL，ddH2O 5 μL；PCR反应在Light Cycler 480平台进行，反应程序为：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。每个样本重复4次。

PCR反应结束后收集循环阈值(Ct),采用2-ΔΔCt法计算ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6基因的相对表达量，使用SPSS 17.0软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 牛优势卵泡GCs与TCs中差异表达基因的筛选

经在线软件GEO2R分析，共获得247个在牛优势卵泡CGs与TCs中差异表达基因：上调表达基因43个，其中差异倍数最高的20个基因及其功能见表2；下调表达基因204个，其中差异倍数最高的20个基因及其功能见表3。从表2和表3可以看出，各基因在GCs和TCs中表达水平均比较高，差异倍数较大，表明这些基因在牛卵泡优势化过程中发挥了重要作用，其中有参与细胞有丝分裂的基因，也有参与细胞发育和内分泌激素调控的基因。例如，前列腺素E2受体EP3基因(PTGER3)参与了子宫收缩；干扰素诱导基因3(IFNT3)促进了干扰素诱导细胞的凋亡；F-Box蛋白5基因(FBXO5)在细胞有丝分裂过程中有重要的调控作用；细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)是性激素合成的关键酶，在膜细胞中参与了雄激素的合成；G蛋白亚单位γ11基因(GNG11)参与了跨膜信号转导，属于卵泡负调控发育因子。

表2 牛优势卵泡GCs与TCs中差异倍数最高的20个上调表达基因及其功能分析Table 2 Top 20 up-regulated genes in GCs and TCs and their functions of dominant follicles in cattle

表3 牛优势卵泡GCs与TCs中差异倍数最高的20个下调表达基因及其功能分析Table 3 Top 20 down-regulated genes in GCs and TCs and their functions of dominant follicles in cattle

2.2 牛优势卵泡GCs与TCs中差异表达基因GO功能富集分析

通过DAVID软件对247个差异表达基因进行GO功能分析，结果(表4)发现，差异表达基因分为3大类41组，其中参与生物学过程的有 22组，主要包括细胞黏附、细胞迁移的正向调控及心脏发育等；参与细胞组分的有12组，主要富集在细胞外的外泌体、细胞外空间及蛋白质的细胞外基质；参与分子功能的有7组，主要在以下功能富集，即钙离子结合、肝素结合、整合素结合及细胞外基质结构成分。

2.4 牛优势卵泡GCs与TCs中差异表达基因KEGG信号通路分析

用KOBAS软件对所获得的差异表达基因进行KEGG信号通路分析，共发现17条通路，其中与本研究内容相关的通路为卵巢类固醇生成通路，其包含ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6 5个基因。

2.5 牛优势卵泡GCs与TCs中Hub基因的PPI网络互作分析

PPI结果(图1)显示，排名前10位的Hub基因分别是透明质酸介导的运动受体基因(HMMR)、着丝粒蛋白F基因(CENPF)、着丝粒蛋白E基因(CENPE)、驱动蛋白家族11基因(KIF11)、Discs大同源物关联蛋白5基因(DLGAP5)、MIS18结合蛋白1基因(MIS18BP1)、表皮细胞转移序列2基因(ECT2)、正核分裂周期蛋白80基因(NDC80)、多梳蛋白复合体1基因(PRC1)、PDZ结合激酶基因(PBK)。

图1 牛优势卵泡GCs与TCs中排名前10位Hub基因的PPI网络互作分析Fig.1 PPI analysis of top 10 Hub genes in GCs and TCs of dominant follicles in cattle

2.6 Real-time PCR验证分析

Real-time PCR结果(表5)显示，CYP17A1、ADCY8在TCs中的表达量极显著高于GCs (P<0.01)；ADCY3、BMP6在TCs中的表达量显著高于GCs (P<0.05) ，GNAS在GCs中的表达量极显著高于TCs (P<0.01)。ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6在GCs和TCs中的表达趋势与GEO芯片数据结果一致。

3 讨 论

卵母细胞、GCs和TCs是雌性动物卵泡的主要组成部分，它们在激素合成、卵泡发育和闭锁过程中起着至关重要的作用[10]。由GCs分泌的胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、激活素和抑制素可以通过自分泌/旁分泌来调节卵巢的功能[11]。TCs不仅支持发育中卵泡的结构，而且为GCs合成雌激素提供雄激素，从而刺激早期卵泡的生长发育[12-13]。在雌性动物卵巢中，激素的生成是由GCs和TCs特异性表达的一系列类固醇酶通过协同作用来完成的[14]。GCs通过缝隙连接将信号传递到卵母细胞，对卵子的发生、形成和成熟以及受精后胚胎发育至关重要[15]。

研究发现，类固醇样原急性调节蛋白(STAR)通过将胆固醇运输到线粒体来调节雄激素的分泌[16]，而TCs所表达的细胞色素P450 11A1 (CYP11A1)、细胞色素CYP17A1和HSD3B2均为雄激素生物合成的关键酶[17]。体外研究表明， TCs的一个关键特征是雄激素分泌的增加是由LH以剂量依赖性的方式驱动的[18-19]。CYP17A1是催化孕烯酮转化为17-羟基孕烯酮和孕酮转化为17-羟基孕酮的定性调节剂，是雄激素生物合成的限速酶[20]。CYP17A1主要表达于肾上腺、睾丸间质细胞和卵巢膜细胞，其活性的增加能够显著促进TCs中雄激素的生物合成和分泌[21]。CYP17A1启动子区翻译起始位点上游-34位点的T突变为C被认为会增加CYP17A1基因的表达，进而导致雄激素的合成增加，这是由于突变增加了转录因子Sp1的结合位点所致[22]。腺苷酸环化酶8 (ADCY8)是一种膜结合酶，在高等脊椎动物中催化ATP形成cAMP。研究表明，慢性输注人类情绪稳定剂卡马西平能够显著降低小鼠的回避行为，这是通过ADCY8活性发挥作用[23]。此外，还有研究指出ADCY8可以促进接受型子宫内膜的形成，在子宫内膜容受性发育中起重要作用[24]。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(GNAS)复合位点能产生多个选择性剪接转录本，GNAS复合位点的转录本以组织特异性的方式被印迹，它与牛的胴体性状、产奶量和生殖性状存在显著相关性[25]。在猪上，有研究证实了GNAS编码多个印迹或双等位基因表达的转录本[26]。在人类中，GNAS复合位点编码片段的突变会导致严重的内分泌疾病，如假性甲状腺机能亢进和垂体肿瘤[27]。ADCY3通过催化信号分子cAMP的形成以响应G蛋白信号。Baxendale等[28]研究表明，减数分裂后的生殖细胞可以产生ADCY3蛋白。敲除小鼠ADCY3后发现其是嗅觉丧失，还会导致雄性小鼠精子活力不足，进而导致不育[29]。在雌性动物中， ADCY3参与了卵母细胞减数分裂信号通路。骨形态发生蛋白6(BMP6)是TGF-akt通路中的一员， BMP6可以抑制cAMP的产生，从而导致STAR和P450scc mRNA的水平降低，却不影响芳香化酶mRNA水平，使孕激素水平显著下降[30]。牛卵泡内GCs和TCs在激素的调控下有序的进行增殖、分化，与其相关的基因也在不同时空准确表达。优势卵泡GCs和TCs协同合成雌激素与抑制素，抑制促卵泡素(FSH)的分泌，导致其他卵泡的发育受阻，最终走向闭锁[31]。本研究通过对GEO数据库GSE83524 RNA-seq表达谱进行分析，共获得247个差异表达基因，其中43个表达上调，204个表达下调。通过对所有差异表达基因进行GO、KEGG信号通路及PPI网络互作分析，共筛选出ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6 5个在卵巢中参与类固醇激素合成的基因，Real-time PCR验证分析结果显示这5个基因在GCs和TCs中的表达趋势与GEO芯片数据结果一致。因此推测这5个基因在牛优势卵泡GCs和TCs中对生殖激素的合成及分泌起了重要作用，为进一步研究其在生殖激素合成及分泌过程中的调控机理奠定基础。

4 结 论

本研究在牛优势卵泡GCs与TCs中获得247个差异表达基因，其中43个基因表达上调，204个基因表达下调。通过GO功能富集、KEGG信号通路分析及PPI网路互作分析，筛选出5个与牛卵泡中类固醇激素合成相关的基因，其中CYP17A1、ADCY8、ADCY3、BMP6在TCs中的表达量均显著高于GCs，GNAS在GCs中的表达量极显著高于TCs，因此推测这5个基因在牛优势卵泡GCs和TCs中对生殖激素的合成及分泌起了重要作用。